土壤中PHA高產(chǎn)菌株的分離及鑒定

王 丹,鞏春甫,陳揚(yáng)威,曾麗萍,何 浪＊

(1.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系,四川成都 610083;2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川成都 610083)

土壤中PHA高產(chǎn)菌株的分離及鑒定

王 丹1,鞏春甫2,陳揚(yáng)威1,曾麗萍1,何 浪1＊

(1.成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系,四川成都 610083;2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川成都 610083)

從成都某煉油廠油罐和排污口附近土壤中分離到1株P(guān)HA(聚羥基烷酸)的高產(chǎn)菌株,最高含量為19.25%。根據(jù)形態(tài)特征觀察、生理生化特征鑒定及16S r DNA序列比對(duì),結(jié)果表明該菌株為蠟狀芽胞桿菌。并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行初步探索,確定培養(yǎng)的最適溫度為37℃,最適pH值為7.0,為下一步構(gòu)建基因工程菌和優(yōu)化發(fā)酵條件提供了理論基礎(chǔ)。

PHA;菌株分離;鑒定;發(fā)酵條件

聚羥基烷酸(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是許多微生物合成的胞內(nèi)能量和碳源貯藏物質(zhì)[1-2]。此物質(zhì)是一種聚脂類物質(zhì),是一種天然的高分子生物材料。PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的熱加工性能。因此,PHA是化學(xué)合成塑料很好的替代品,可減少甚至消除“白色垃圾”對(duì)環(huán)境的污染。同時(shí),PHA還具有非線性光學(xué)性、壓電性、氣體相隔性很多高附加值性能。因此,PHA作為一種新型生物醫(yī)用材料及生物可降解包裝材料,逐漸成為生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點(diǎn)。本研究擬篩選到1株P(guān)HA的高產(chǎn)菌株,并通過形態(tài)學(xué)及生理生化、分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行初步確定,為后續(xù)的構(gòu)建基因工程菌及優(yōu)化發(fā)酵條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 成都某煉油廠油罐及排污口附近采集的土壤樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,定容至1 L,pH7.4～7.6;②牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂粉15 g,定容至1 L, pH 7.4～7.6。

1.1.3 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA Marker、PCR mix、DNA凝膠回收試劑盒,上海生工生物工程有限公司;X-gal、氨芐青霉素、IPTG,Sigma公司,其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將土壤樣品10 g加入100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中振蕩20 min,形成土壤懸濁液后于37℃,200 r/min,富集培養(yǎng)16 h。再將培養(yǎng)液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度稀釋、涂平板,選擇菌落分散較好的、稀釋濃度為10-3、10-4、10-5的平板挑單菌落,再經(jīng)反復(fù)純化獲純菌株。

1.2.2 初篩 按常規(guī)方法[3]制取菌懸液涂片,吸干水分。以二甲苯?jīng)_洗涂片至無色素洗脫,再用0.5%番紅染色液復(fù)染2 min,水洗,吸干。通過顯微鏡觀察,將視野中細(xì)胞內(nèi)含有70%藍(lán)黑色顆粒的菌株視為產(chǎn)PHA菌株[4-5]。

1.2.3 復(fù)篩 將初篩獲得的菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃,200 r/min,48 h,培養(yǎng)液在4000 r/min,離心10 min,收集菌體,并于65℃烘干,再用硫酸降解法[2,6-8]測(cè)定PHA含量,獲得高產(chǎn)菌株8-2。

1.2.4 菌種鑒定 ①形態(tài)學(xué)和生理生化特征:革蘭染色、芽胞染色、莢膜染色,方法參見文獻(xiàn)[9]。對(duì)菌株8-2進(jìn)行淀粉水解、油脂水解、尿素水解、明膠水解、石蕊牛奶、糖酵解、伏普試驗(yàn)、卵磷脂酶、接觸酶等生理生化特征鑒定的試驗(yàn),并依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]對(duì)菌株8-2進(jìn)行初步鑒定;②細(xì)菌總DNA的提取:細(xì)菌總DNA的提取采用CTAB法[3];③16S rDNA的PCR擴(kuò)增:以細(xì)菌基因組DNA為摸板,以通用引物F27(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和R1492(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)擴(kuò)增16S r DNA。PCR的反應(yīng)體系(25μL):DNA模板(細(xì)菌總DNA稀釋50倍)1μL,10×Ex Buffer 2.5μL,正向引物1與反向引物2各1μL,Taq酶0.2μL, dNTP 1.5μL,ddH2O 17.8μL;PCR反應(yīng)條件:95℃5 min,然后95℃變性1 min,54℃退火1 min, 72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用Tiangen公司的凝膠回收試劑盒純化。回收片段連接到pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化E. coliDH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒送華大基因公司(北京)完成測(cè)序工作;④序列分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建:根據(jù)供試菌株的16S r DNA序列,運(yùn)用Blast程序在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源序列搜索。根據(jù)同源序列搜索的結(jié)果,下載相關(guān)菌種的16S rDNA序列,與供試菌株的序列一同用Clustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果采用MEGA3.1中的鄰接法(Neighbor.Joining)進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建,并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1000次可信度分析。

1.2.5 發(fā)酵條件的初步確定 按照2%的接種量將菌株8-2接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)。利用單因素實(shí)驗(yàn)方法,分別在不同溫度、pH的條件下培養(yǎng)30 h后,測(cè)定PHA的百分含量,確定其發(fā)酵的最適溫度和pH值。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離與篩選

通過樣品的富集和劃線分離、純化,蘇丹黑B染色進(jìn)行初篩,顯微鏡視野中70%以上的細(xì)胞內(nèi)含有藍(lán)黑色顆粒的菌株共有12株,分別培養(yǎng)于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,測(cè)定PHA的百分含量(表1),其中菌株8-2的PHA含量最高。

表1 分離菌株的PHA百分含量Table 1 PHA%of partial separation strains

2.2 菌株8-2個(gè)體形態(tài)特征及菌落形態(tài)特征

將菌株8-2進(jìn)行革蘭染色、芽胞染色及莢膜染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)特征(表2),觀察瓊脂平板上菌株8-2的單菌落,總結(jié)其菌落特征(表3)。

表2 菌株8-2的個(gè)體形態(tài)特征Table 2 The microscopic characters of strain 8-2

表3 菌株8-2的菌落特征Table 3 The colony characters of strain 8-2

2.3 生理生化特征

菌株8-2為好氧和兼性厭氧,能產(chǎn)生胞外淀粉水解酶、脂肪酶、明膠酶、尿素酶,能水解酪素,對(duì)乳糖和甘露醇發(fā)酵的結(jié)果為不產(chǎn)酸,對(duì)葡萄糖發(fā)酵的結(jié)果為產(chǎn)酸,接觸酶陽性。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》將8-2菌株初步認(rèn)定為芽胞桿菌屬(B acillussp.)。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

以菌株8-2的基因組DNA為模板用PCR擴(kuò)增出16S rDNA基因的部分片段,對(duì)該片段進(jìn)行序列分析后,利用Blast軟件將該序列與GenBank中收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì),并與相關(guān)菌種構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖1)。結(jié)果顯示,菌種8-2與Bacillus cereusATCC 21281(FJ501984)聚成1支,序列同源性為100%,表明兩者親緣關(guān)系最近,可確定菌株8-2為蠟狀芽胞桿菌。菌株8-2的16S rDNA序列長度為1206 bp,其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登陸號(hào)為HQ162277。

圖1 基于16S rDNA序列和Neighbor-Join ing法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis based on 16S r DNA sequence alignment

2.5 發(fā)酵條件初步確定

2.5.1 最適溫度 將菌株8-2按照2%的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng),溫度分別控制在30、32、35、37、39℃,培養(yǎng)30 h后,測(cè)定PHA的百分含量(圖2)。隨著培養(yǎng)溫度的不斷上升,PHA百分含量逐漸增加。當(dāng)溫度達(dá)到37℃后,PHA百分含量達(dá)到最大值26.17%,之后隨著溫度的繼續(xù)上升,PHA百分含量下降,當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到39℃后,PHA百分含量降為22.10%。因此,確定37℃為培養(yǎng)的最適溫度。

2.5.2 最適pH值 將菌株8-2按照2%的接種量接種到不同pH值的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min搖床培養(yǎng)30 h后,測(cè)定PHA的百分含量(圖3)。隨著培養(yǎng)基pH值的不斷上升,PHA百分含量逐漸增加。當(dāng)pH到7時(shí),PHA百分含量達(dá)到最大值26.17%,之后隨著值的繼續(xù)上升,PHA百分含量下降。因此,確定pH 7.0為培養(yǎng)的最適pH值。

圖3 pH值對(duì)PHA產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of pH value on the PHA yield

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的深入發(fā)展,人們已逐漸認(rèn)識(shí)到僅靠形態(tài)、生理、生化等特征進(jìn)行的細(xì)菌學(xué)分類與鑒定存在一定的局限與不足—缺乏基因水平(分子層面)的數(shù)據(jù)作支持,不足以對(duì)細(xì)菌的分類與鑒定提供充分有力的證據(jù)[11]。而細(xì)菌的16S rDNA(編碼16S rRNA的基因)在漫長的進(jìn)化中具有高度的保守性且其長度適中(約1500個(gè)核苷酸)便于測(cè)序,研究人員通過對(duì)未知細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行測(cè)序和比較分析,即可達(dá)到細(xì)菌分類與鑒定的目的[12]。因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定時(shí),在形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定的基礎(chǔ)上,結(jié)合分子鑒定來準(zhǔn)確地鑒定篩選菌株,可為進(jìn)一步研究菌株特性提供指導(dǎo)意義。

目前,國內(nèi)外采用多種方法來降低PHA的合成成本,其中篩選PHA的高產(chǎn)菌株是較為直接、且有效的途徑。下一步將對(duì)8-2菌株進(jìn)行誘變處理以期提高PHA產(chǎn)量,并構(gòu)建基因工程菌,進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件,為降低PHA的生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)。

[1]Russell R A,Holden P J,Garvey C J,et al.Investigation of the phase morphology of bacterial PHA inclusion bodies by contrast variation SANA[J].Physica B,2006,385-386:859-861.

[2]李季倫.一株產(chǎn)生聚-羥基烷酸細(xì)菌的篩選和鑒定[J].中國公共衛(wèi)生,2000,16(5):449-451.

[3]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1999.

[4]李凌凌,呂早生,沈慧莉,等.產(chǎn)聚羥基烷酸的菌株分離及初步鑒定[J].武漢科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,30 (5):502-505.

[5]張?jiān)?產(chǎn)聚羥基烷酸的菌株分離鑒定[J].江蘇石油化工學(xué)院學(xué)報(bào),2000,12(4):18-19.

[6]Holmes P A.Biologically produced PHA polymers and copolymers[J].In:Developments in crystalline polymers,Bassett DC (ed),Elsevier,1988,2:1-65..

[7]Fritzsche k,Lenz R W,Fuller R C.Production of unsaturated polyesters by Pseudomonas oleovorans[J].Biol Macromol, 1990,12:85-91.

[8]Bloembergen S,Holden D A,Hamer G K,et al.Study of composition and crystallization of bacterial poly(β-hydroxybutyrateco-β-hydro-xyvalerate)[J].Macromolecules,1986,19:2865-2871.

[9]黃文芳,張松.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].廣州:暨南大學(xué)出版社,2003.

[10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[11]張會(huì)敏,馮友軍.一株野生細(xì)菌的16S r DNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[J].生物信息學(xué),2005,1(3):1-4.

[12]張彤,方漢平.微生物分子生態(tài)技術(shù):16S rRNA/DNA方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2003,30(2):97-101.

Isolation and Identification of PHA High-Producing Stra in from Soil

WANGDan1, GONG Chun -f u2, CHEN Yang -wei1, ZENG Li-ping1, H E L a n g1
(1.Dept.of Biomedicine , of , 2.Sch.of Basic Med.of Chengdu Medical College , Chengdu 610083 )

A polyhydroxyalkanoate(PHA)high-yielding strain was isolated and purified from soil samples collected from neighboring site of oil storage tanks and the sewage outfall of a refinery in Chengdu,and the highest content of PHA was 19.25%(W/DW).Based on the morphological observation,physiological and biochemical characteristics and the result of sequences comparison and verification of 16S r DNA,the strain was identified as Bacillus cereus.Preliminary experiment of its fermentation conditions was confirmed that the optimal culture temperature and pH were 37℃,and 7.0.These had provided a theoretical basis for further study on the construction of building a recombinant engineering strain that could produce PHA and the optimization of the fermentation conditions.

polyhydroxyalkanoate(PHA);strain isolation;identification;fermentation conditions

Q93-3

B

1005-7021(2010)06-0093-04

成都醫(yī)學(xué)院校級(jí)科研課題項(xiàng)目(CYZ07-012)

王丹 女,講師。研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與微生物學(xué)。E-mail:wangdan770815@yahoo.com.cn

＊通訊作者。E-mail:helang79@sohu.com

2010-09-30;

2010-11-03