Rhodobacter sphaeroides偶氮還原酶三級結(jié)構(gòu)同源建模與分析

柳 廣 飛, 周 集 體, 王 競, 周 覓

(大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院,遼寧大連 116024)

0 引 言

偶氮染料是分子中具有一個或多個偶氮基的芳香類化合物,由于其易于合成且性質(zhì)穩(wěn)定,被廣泛應(yīng)用于印染、紡織、食品和制藥等行業(yè)中[1].上述行業(yè)產(chǎn)生的染料廢水的處理一直備受關(guān)注.相對于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法,微生物法對染料廢水的處理由于其成本低廉、環(huán)境友好而成為人們研究的熱點.細菌的偶氮還原酶將電子傳遞給偶氮染料而使其偶氮鍵斷裂,在偶氮染料的脫色降解中發(fā)揮著重要作用.近年來,人們從廢水、土壤、皮膚等不同來源的微生物中得到了多種偶氮還原酶.其中除了源自 Pigmentiphaga kullae和Xenophilus azovorans的偶氮還原酶外,大都在分子中含有黃素單核苷酸(FMN)輔基,統(tǒng)稱為依賴黃素的偶氮還原酶(flavin-dependent azoreductase)[2].

目前研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要方法有X-射線衍射和核磁共振等,但這些方法往往成本昂貴,成功率低.近些年來,隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,人們所獲得的基因和蛋白質(zhì)序列越來越多,積累了大量的生物信息,與計算機和信息技術(shù)相結(jié)合,逐漸形成了一系列嶄新的、以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)的預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)、構(gòu)建結(jié)構(gòu)模型的方法.同源建模法(homology modeling method)是在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中尋找未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的同源伙伴,再將同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化而構(gòu)建出預(yù)測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)[3].

本文利用同源建模方法構(gòu)建Rhodobacter sphaeroides偶氮還原酶AZR的三級結(jié)構(gòu)模型,并在此基礎(chǔ)上探討依賴黃素的偶氮還原酶的分類與結(jié)構(gòu)特征.

1 材料和方法

1.1 材 料

以本實驗室克隆測序的Rhodobacter sphaeroides(R.sphaeroides)偶氮還原酶基因azr(GenBank登錄號AY150311)[4],翻譯成偶氮還原酶 AZR蛋白序列(GenBank登錄號AAN17400)作為分析的模板序列.

1.2 應(yīng)用軟件、數(shù)據(jù)庫與服務(wù)器

序列對齊分析采用GeneDoc軟件完成;進化樹采用MEGA軟件構(gòu)建;應(yīng)用Swiss PdbViewer(DeepView)軟件構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型;采用PyMOL軟件分析三級結(jié)構(gòu)模型;采用Whatcheck與Procheck軟件進行模型評價.

基因與蛋白質(zhì)序列檢索比對數(shù)據(jù)庫:National Center for Biotechnology Information/GenBank(NCBI/GenBank,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫:Research Collaboratory for StructuralBioinformatics/Protein Data Bank(RCSB/PDB,http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do);蛋白質(zhì)同源建模服務(wù)器:SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL);蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)比較服務(wù)器:DALI(http://www.ebi.ac.uk/dali).

1.3 同源建模的方法

(1)新建一個 FASTA格式的偶氮還原酶AZR的蛋白序列文件.

(2)打開軟件 SwissPdbViewer,在SwissModel菜單下選擇 Load Raw Sequence to Model命令;在新對話框中打開序列文件.

(3)尋找合適模板結(jié)構(gòu).在SwissModel菜單下選擇Find Appropriate ExPDB Templates.

(4)選擇合適模板(1NNI)并用 Swiss PdbViewer打開.

(5)序列對齊.在Wind菜單下選擇Sequence Alignment命令,進行目標結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)的序列對齊.

(6)結(jié)構(gòu)模擬與調(diào)整.在 Fit菜單下選擇Magic Fit命令,初步進行結(jié)構(gòu)模擬;在Select菜單下選擇aa Making Clashes命令,然后在Tools菜單下選擇Fix Selected Sidechains下的Quick and Dirty進行調(diào)整.

(7)提交構(gòu)建模型申請.選擇SwissModel菜單下的Submit Modeling Request命令,填寫相關(guān)信息后等待服務(wù)器返回結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 AZR蛋白序列的對齊分析

以AZR的蛋白序列在GenBank中進行BLAST搜索,根據(jù)搜索結(jié)果利用GeneDoc軟件進行對齊分析.如圖1所示,AZR與來自Bacillus sp.OY1-2、Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus、Saccharomyces cerevisiae 和 Pseudomonas aeruginosa的蛋白分別有 97%、51%、21%、20%和15%的序列一致性.Pro72-Gly111之間的氨基酸殘基具有較高的相似性,其中包括一個新的黃素氧化還原蛋白家族的特征序列(P-X-Y-H/N-6X-L-K-N-S/A-L/I-D)[5]和一個參與 NAD(P)H結(jié)合的甘氨酸富集區(qū)(G-G-G-K/H-G-G).

2.2 AZR的結(jié)構(gòu)模型

利用Swiss PdbViewer軟件和SWISS-MODEL服務(wù)器開展模型構(gòu)建工作.通過搜索,在PDB中發(fā)現(xiàn)一個與AZR具有51%序列一致性的已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),編號為1NNI,為源自B.subtilis的蛋白YhdA.按照生物信息學(xué)理論,如果兩種蛋白質(zhì)在連續(xù)100個氨基酸范圍內(nèi)有大于40%的一致性,那么它們在結(jié)構(gòu)上則具有較為顯著的相似性,已知結(jié)構(gòu)的蛋白可以作為建立目標蛋白結(jié)構(gòu)模型的模板.此種情況下,按照同源建模方法能夠提供詳細而又準確的結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果.因此,本文采用1NNI作為模板開展AZR的結(jié)構(gòu)預(yù)測工作.

圖1 AZR與相似黃素氧化還原蛋白的序列對齊分析Fig.1 Multiple sequence alignment of AZR with similar flavodoxins

經(jīng)前述方法中的步驟,得到如圖2所示的AZR三級結(jié)構(gòu)模型.AZR結(jié)構(gòu)模型Ramachandran圖中所有氨基酸殘基均分布在允許的范圍內(nèi)(favoured and allowed regions),無不允許殘基位置出現(xiàn),模型中蛋白質(zhì)主鏈殘基的二面角構(gòu)象合理;Procheck與WhatCheck的評價結(jié)果表明模型的結(jié)構(gòu)和均方根Z大多在允許范圍內(nèi),模型較為合理,可用來分析AZR的結(jié)構(gòu).

圖2 AZR的三級結(jié)構(gòu)模型Fig.2 3D structure model of AZR

AZR為α/β型結(jié)構(gòu),分子中含有5個α螺旋,5個β折疊,螺旋與折疊交替出現(xiàn).5個β折疊相互平行,形成一個平面,位于分子的中間;α螺旋分列于平面的兩側(cè),一側(cè)2個,另一側(cè)3個;在β折疊的C端非共價地結(jié)合一個黃素單核苷酸(FMN)分子.生物化學(xué)中把這類由一條多肽鏈結(jié)合一個黃素輔基(FMN或FAD)組成的蛋白稱為黃素蛋白(flavoprotein),每個輔基能夠提供兩個質(zhì)子和電子;相對分子質(zhì)量在15～22 kDa,分子結(jié)構(gòu)為α/β型,非共價地結(jié)合一個FMN作為氧化還原中心的黃素蛋白又稱為黃素氧化還原蛋白(flavodoxin).因此,AZR為一種黃素氧化還原蛋白.

通過DALI服務(wù)器將AZR的結(jié)構(gòu)與所有已知蛋白結(jié)構(gòu)進行比較,結(jié)構(gòu)相似程度最高的即為本文作為模板的1NNI,Z=32.5,均方根偏差Drms=0.4.其他相似結(jié)構(gòu)還包括1RTT,Z=19.2,Drms=1.8;2FZV,Z=19.1,Drms=1.8等.關(guān)于這些蛋白的功能報道并不一致,但它們都屬于黃素氧化還原蛋白,分子結(jié)構(gòu)都為α/β型三明治結(jié)構(gòu).

2.3 AZR的乒乓動力學(xué)機理

此前研究發(fā)現(xiàn)AZR在還原偶氮類化合物時遵循雙底物乒乓動力學(xué)機理.由對AZR的結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn),作為黃素氧化還原蛋白的AZR中存在著FMN這一氧化還原反應(yīng)中心,因此,乒乓機理可更具體地表示如下(其中E表示偶氮還原酶AZR,S表示電子受體底物,P表示產(chǎn)物):

NAD(P)H為電子供體,另一底物(如偶氮染料)為最終電子受體.在雙底物乒乓動力學(xué)反應(yīng)過程中,AZR分子中的FMN輔基作為中介,首先獲得NAD(P)H提供的電子,變成還原態(tài)FMNH2;NAD(P)+離開反應(yīng)中心后,另一底物分子進入其中,從FMNH2獲得電子而被還原,同時AZR回復(fù)到初始狀態(tài).

2.4 依賴黃素的偶氮還原酶分類

通過序列對齊分析發(fā)現(xiàn),依賴黃素的偶氮還原酶按序列相似性可以歸入兩個家族,分別以R.sphaeroides的偶氮還原酶 AZR和 Escherichia coli的偶氮還原酶AzoR為代表;兩個家族之間無序列同源性可言.

分別由上述兩種代表性的偶氮還原酶的序列,通過NCBI的TBLAST尋找相似序列,并利用MEGA 4.0軟件以鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建兩類依賴黃素的偶氮還原酶家族的進化樹(見圖3).

圖3 兩類依賴黃素的偶氮還原酶家族的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of two flavin-dependent azoreductase families

圖3中各物種及其GenBank登錄號如下:B.anthracis AE017334,B.cereus AE016877,Bacillus sp.OY1-2 AB032601,R.sphaeroides AY150311, B. thuringiensis CP000485,B.licheni f ormis AE017333, B. subtilis AB071366,G.stearothermophilus AB071367,H.marismortui AY596297, S.aureus AY545994, P. aeruginosa AE004091,S.cerevisiae AY558199, B. henselae BX897699,B.anthracis AE017225,B.cereus CP000001, C. perf ringens BA000016,L.monocytogenes AE017262, E.f aecalis AY122207,L.lactis AE006275,S.boydii CP000036,E.coli NC000913,S.ty phimurium AE008772,P.f luorescens CP000094.

光合細菌R.sphaeroides偶氮還原酶AZR所屬的第一類家族中偶氮還原酶的結(jié)構(gòu)此前未見報道.而來自第二類家族偶氮還原酶的三級結(jié)構(gòu)的報道表明E.coli和E.f aecalis的偶氮還原酶AzoR和 AzoA,PDB代號分別為1V4B和2HPV,也是α/β型的黃素氧化還原蛋白,分子中央為5個相互平行的β折疊構(gòu)成的平面,6個α螺旋分列兩側(cè),一側(cè)2個,另一側(cè)4個[6、7].

如圖4,利用PyMOL軟件比較兩類依賴黃素的偶氮還原酶的結(jié)構(gòu).可以發(fā)現(xiàn),盡管兩類偶氮還原酶家族在氨基酸序列上無同源性可言,但它們的三級結(jié)構(gòu)非常相似,分子中FMN輔基的結(jié)合位置和方式也很相似.兩類序列上無同源性卻具有相同功能的偶氮還原酶家族在本質(zhì)上是同一類黃素氧化還原蛋白.蛋白質(zhì)科學(xué)中認為結(jié)構(gòu)決定功能,這一發(fā)現(xiàn)加深了對具有偶氮還原酶活性的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的認識,蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)要比其序列的保守性更高.

圖4 AZR(灰色)與AzoR(黑色)的結(jié)構(gòu)對比Fig.4 Structure comparison of AZR(gray)and AzoR(black)

2.5 依賴黃素的偶氮還原酶活性區(qū)域分析

結(jié)合對AZR三級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn),序列對齊分析中所發(fā)現(xiàn)的兩處保守序列,黃素氧化還原蛋白特征序列和甘氨酸富集區(qū)分別對應(yīng)著FMN附近的兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Loop 1和Loop 2).特別地,在另一類依賴黃素的偶氮還原酶,E.coli的AzoR中也發(fā)現(xiàn)了類似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖5).有報道認為Loop 1可能參與對FMN的結(jié)合;而位于嘧啶環(huán)附近的Loop 2可能是參與NAD(P)H結(jié)合的位點[8、9].這進一步證明了盡管兩類依賴黃素的偶氮還原酶的蛋白序列無相似性,但其功能是有相似的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的.

圖5 R.sphaeroides和E.coli的依賴黃素偶氮還原酶FMN輔基附近的保守環(huán)狀結(jié)構(gòu)Fig.5 Conserved loops around FMN cofactors of flavin-dependent azoreductases from R.sphaeroides and E.coli

3 結(jié) 論

(1)序列對齊分析發(fā)現(xiàn)R.sphaeroides偶氮還原酶AZR的蛋白序列中存在兩處保守功能序列,即一類新的黃素氧化還原蛋白的特征序列和一個參與NAD(P)H結(jié)合的甘氨酸富集區(qū).

(2)利用同源建模法,構(gòu)建了AZR的三級結(jié)構(gòu)模型,AZR為一α/β型的黃素氧化還原蛋白,蛋白分子呈三明治結(jié)構(gòu),含有一個FMN輔基,參與雙底物乒乓動力反應(yīng)的電子傳遞.

(3)根據(jù)序列對齊分析,可將依賴黃素的偶氮還原酶分為兩個家族,分別構(gòu)建了兩個家族的進化樹.

(4)盡管兩類依賴黃素的偶氮還原酶在序列上無相似性可言,但它們的三級結(jié)構(gòu)非常接近,都是α/β型的黃素氧化還原蛋白,FMN輔基的結(jié)合位置與方式也很相似,輔基周圍保守存在著兩個環(huán)狀區(qū)域.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)比其氨基酸序列的保守性更高.這一認識為發(fā)現(xiàn)新的偶氮還原酶及其編碼基因和深入研究AZR的功能奠定了基礎(chǔ).

[1]RAFFIF,HALL JD,CERNIGLIA C E.M utagenicity of azo dyes used in foods,drugs and cosmetics before and after reduction by Clostridium species from the human intestinal tract[J].Food and Chemical Toxicology,1997,35(9):897-901

[2]CHEN H.Recent advances in azo dye degrading enzyme research[J].Current Protein and Peptide Science,2006,7(2):101-111

[3]諶 容,陳 敏,楊春賢,等.基于SWISS-MODEL的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模[J].生命的化學(xué),2006,26(1):54-56

[4]YAN Bin,ZHOU Ji-ti,WANG Jing,etal.Expression and characteristics of the gene encoding azoreductase from Rhodobacter sphaeroidesAS1.1737[J].FEMS Microbiology Letters, 2004,236(1):129-136

[5]LIU Guang-fei,ZHOU Ji-ti,LV Hong,et al.Azoreductase from Rhodobacter sphaeroidesAS1.1737 is a flavodoxin that also functions as nitroreductase and flavin mononucleotide reductase[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,76(6):1271-1279

[6]ITOK,NAKANISHIM,LEEW C,etal.Three-dimensional structure of AzoR from Escherichia coli.An oxidereductase conserved in microorganisms[J].The Journal of Biological Chemistry,2006,281(29):20567-20576

[7]LIU Z J,CHEN H,SHAW N,et al.Crystal structure of an aerobic FMN-dependent azoreductase(AzoA)from Enterococcus faecalis[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2007,463(1):68-77

[8]CHENH,HOPPERSL,CERNIGLIA CE.Biochemical and molecularcharacterization of an azoreductase from Staphylococcus aureus, a tetrameric NADPH-dependent flavoprotein [J].Microbiology,2005,151(5):1433-1441

[9]LIGER D,GRAILLE M,ZHOU C Z,et al.Crystal structure and functional characterization ofyeast YLR011wp,an enzyme with NAD(P)H-FMN and ferriciron reductase activities[J].Journalof Biological Chemistry,2004,279(33):34890-34897