PRKAA2基因多態性與2型糖尿病患者血脂的關系

馬 寧 張吉平 劉 靜

（1.徐州醫學院附屬連云港醫院內分泌科，江蘇 連云港 222002；2.蘭州大學臨床醫學院，甘肅 蘭州 730030）

腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調解糖、脂肪、蛋白質代謝中發揮著重要作用。最近許多研究表明AMPK可能在2 型糖尿病的運動治療中發揮了重要作用，故AMPK 對糖脂代謝的影響受到高度重視，相關研究也日趨深入。2型糖尿病患者普遍存在胰島素抵抗，有證據表明AMPK通過影響脂代謝在改善胰島素抵抗方面發揮重要作用[1]。因此，我們通過單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)研究方法分析AMPKα2亞單位編碼基因PRKAA2與2型糖尿病患者血脂的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

按照世界衛生組織（World Health Organization，WHO）1999年診斷標準隨機選擇104例糖尿病患者。

1.2 方法

①用酚/氯仿法抽取基因組DNA；②位點選擇：使用SNPbrowser軟件，按照pairwise r2算法選擇PRKAA2基因標簽SNP（Tagging SNP，tSNP）。設定R2=0.8，MAF=0.2，選擇rs2796495位點進行檢測；③PCR擴增：上游引物5′ctcacatcactgctaggaaacc3′，下游引物5′taggactcatacccaaacg3′。擴增采用降落PCR，即95℃預變性3 min，繼之95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，每5個循環退火溫度降低2℃直至53℃，共30個循環，最后72℃延伸7 min；④ 突變檢測：擴增樣本經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用變性高效液相色譜儀檢測突變。上樣量為5 μL，退火溫度經WAVE軟件分析后確定為54.5℃。所有樣本經第一次檢測后隨機抽取單峰樣本和非單峰樣本測序，確定其基因型（樣本送上海生工進行測序）。將所有單峰樣本與測序野生型樣本等體積混合，經變性退火后進行第二次DHPLC檢測，以區分野生型和純和突變。

1.3 統計學分析

Hardy-Weinberg平衡定律檢測基因型群體代表性。計數資料比較采用χ2檢驗。計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。不滿足正態分布和方差齊性時采用非參數檢驗。采用SPSS 11.5進行統計分析，以P＜0.05（雙側）為有統計學意義。

經Hardy2Weinberg 遺傳平衡定律檢驗χ2=0.0049，P=0.944，表明各基因型頻率已達遺傳平衡，具有群體代表性(表1)。

2 結果

2.1 基因頻率分布

表1 rs2796495不同基因型者一般資料比較(±s)

表1 rs2796495不同基因型者一般資料比較(±s)

基因型 CC CT TT例數(n)（男/女）43(28/15) 48(32/16) 13(8/5)年齡(歲) 55±2 58±2 56±3體重指數(kg/m2)24.36±0.55 24.61±0.42 26.00±0.68空腹血糖(mmoL/L)11.47±0.96 12.44±0.95 13.96±2.28 2小時血糖(mmoL/L)17.41±1.12 18.69±1.47 18.74±3.07

2.2 不同基因型間血脂水平比較

總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）比較顯示三組間不完全相同，P值分別為0.018、0.012。CC、CT、TT三組間總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇依次升高，其中CC與TT型比較差異有統計學意義，P值分別為0.047、0.028。但是經年齡、性別、體重指數校正后TC間的差異失去統計學意義（P=0.086），LDL-C間的差異仍有統計學意義（P=0.037）(表2)。

表2 rs2796495基因型間血脂水平比較(±s)

表2 rs2796495基因型間血脂水平比較(±s)

注：a：CC型與TT型比較P＜0.05，b：CT型與TT型比較P＜0.05，c：經自然對數轉換后進行統計。

基因型 總膽固醇 甘油三脂c 高密度脂蛋白膽固醇c 低密度脂蛋白膽固醇(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)CC 4.51±1.41a 2.11±0.98 0.93±0.29 1.95±0.76a CT 4.96±1.24 1.84±0.82 0.92±0.21 2.15±0.56 TT 5.51±0.90 2.38±1.92 1.07±0.25 2.55±0.95

3 討論

AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是由α、β、?三個亞基組成的異源三聚體蛋白，其中α亞基又包括α1、α2兩個亞單位。不同的亞單位由不同的基因編碼，其中α2亞單位的編碼基因為PRKAA2。對AMPK基因敲除小鼠研究發現α2基因敲除小鼠出現胰島素抵抗[1]。AMPK蛋白與血脂代謝有著密切關系。乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)和羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)分別在脂肪酸和膽固醇的合成中起關鍵作用[2]。ACC是脂肪酸合成的限速酶，而HMGR為膽固醇合成的限速酶。ACC和HMGR 均是AMPK的靶分子。激活的AMPK可以使它們磷酸化，抑制它們的功能，從而抑制肝脂肪酸和膽固醇的合成[3]。此外AMPK還參與了甘油三酯的調節。在脂肪細胞中，AMPK激動劑不僅可通過ACC 磷酸化而抑制脂肪生成，還可通過磷酸化抑制激素敏感脂肪酶，從而抑制異丙腎上腺素所誘導的脂肪分解[4]。另外，AMPK能抑制肝細胞中重要的脂肪生成轉錄因子—固醇調節元件結合蛋白（SREBP-1）的mRNA和蛋白質的表達[5]。AMPK這種既調節脂肪合成，又對抗脂肪分解的作用，可以減少血液中游離脂肪酸濃度，減少脂毒性。Horikoshi[6]等研究發現編碼α2亞單位的基因PRKAA2多態性與日本人群胰島素抵抗和2型糖尿病有關。Spencer-Jones[7]等對英國正常婦女PRKAA2基因的5個tSNP位點研究發現其多態性均與低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇變化有關。我們的研究提示編碼AMPKα2亞基的PRKAA2基因的tSNP rs2796495多態性位點與膽固醇水平相關，有突變T等位基因的個體其膽固醇，尤其是低密度脂蛋白膽固醇更高。這與AMPK蛋白的功能相一致。基因的功能是通過其編碼的蛋白質發揮的，因此考慮rs2796495的變異可能影響到了AMPK蛋白的表達活性。

綜上所述，本研究結果顯示PRKAA2基因標簽SNP rs2796495與低密度脂蛋白膽固醇水平密切相關，其進一步的研究對預防糖尿病血管并發癥的發生有一定臨床意義。需強調的是，該多態性位點雖然是一個標簽SNP位點，但其位于基因的內含子，因此，這一多態性是否會直接引起基因的功能或表達改變，或者僅僅是與真正的致病性多態性位點呈連鎖不平衡的一個多態性標志，還有待于進一步的研究證實。

[1]Villena JA,Viollet B,Andreelli F,et al.Induced adiposity and adipocyte hypertrophy in mice lacking the AMP-activated protein kinasealpha2 subunit[J].Diabetes,2004,53(9):2 242-2 249.

[2]Kemp BE,Stapleton D,Campbell DJ,et al.AMP-activated protein kinase,super metabolic regulator[J].Biochemical Society transactions,2003,31(1):162-168.

[3]Henin N,Vincent MF,Gruber HE,et al.Inhibition of fatty acid and cholesterol synthesis by stimulation of AMP-activated protein kinase[J].FASEB J,1995,9(7):541-546.

[4]Sullivan JE,Brocklehurst KJ,Marley AE,et al.Inhibition of lipolysis and lipogenesis in isolated rat adipocytes with AICAR,a cellpermeable activator of AMP-activated protein kinase[J].FEBS Lett,1994,353(1):33-36.

[5]Zhou G,Myers R,Li Y,et al.Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action[J]. J Clin Invest,2001,108(8):1 105-1 107.

[6]Horikoshi M,Hara K,Ohashi J,et al.A polymorphism in the AMPKalpha2 subunit gene is associated with insulin resistance and type 2 diabetes in the Japanese population[J].Diabetes,2006,55(4):919-923.

[7]Spencer-Jones NJ,Ge D,Snieder H,et al.AMP-kinase alpha2 subunit gene PRKAA2 variants are associated with total cholesterol,low-density lipoproteincholesterol and high-density lipoprotein-cholesterol in normal women[J].Journal of medical genetics,2006,43(12):936-942.