六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞的影響

肖子曾 ，趙 婧 ，戴 冰 *，冷 旺 ，梅 君 ，李興豐

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學碩士研究生班，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

六味地黃方是臨床療效非常顯著的滋陰補腎的經典名方，被后人譽為“補陰方藥之祖”。近年來，對于六味地黃方體外試驗的報道甚多，但對于該方的體內試驗相對較少。六味地黃方被制成多種劑型，除了傳統的丸劑及湯劑，還有顆粒劑和超微飲片。超微飲片作為一種新劑型，以其節省藥材、方便衛生的特點已被眾多患者所接受[1]，而對于六味地黃方超微飲片的體內作用如何，報道甚少。有研究表明口服六味地黃湯能明顯降低實驗性高血脂大鼠總膽固醇和肝中脂肪含量[2]，提示其對脂肪細胞的增殖、分化可能有一定影響。為觀察六味地黃方超微飲片對脂肪細胞的增殖、分化究竟有無影響，現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 20只健康Wistar大鼠，清潔級，雌雄各半，體質量 （200±20）g；由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號:醫動字第20-002號。

1.1.2 藥物 六味地黃方超微飲片：熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓超微飲片 （湖南春光中藥飲片公司，批號：050512）

1.1.3 試劑 地塞米松(批號 123K06612)，胰島素(批號024K1188)，含酚紅 DMEM低糖培養基(批號123K83031)，磷酸二羥丙酮(批號027K1635),上述試劑均購自Sigma公司；MTT(批號1313Bl1)購自Amresco公司；標準胎牛血清(批號20050617)購自蘭州民海生物工程有限公司；油紅0(批號830120)購自北京夏新試劑分裝廠；DMSO購自宜興市化工廠；雙蒸水；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 六味地黃方超微飲片灌胃溶液的制備 六味地黃方各單味藥材超微飲片按比例 （熟地黃∶山茱萸∶山藥∶丹皮∶澤瀉∶茯苓=8∶4∶4∶3∶3∶3）混合共 75 g，加水至 450 mL 使其充分溶解，放置20 min后過濾，將濾液濃縮至含生藥為2 g/mL。

1.2.2 動物分組及給藥 將健康Wistar大鼠隨機分為空白對照組、六味地黃方超微飲片2組，每組10只，雌雄各半，禁食12 h（自由飲水）。給予空白對照組生理鹽水、六味地黃方超微飲片組按照每次30 g/kg（以生藥材含量計）劑量（即1.5 mL/100 g。藥物劑量按照60 kg成人體表面積換算），分別給予大鼠灌胃，1次/d，連續3 d。

1.2.3 空白及含藥血清制備 上述各組大鼠于第3天最后1次灌胃1 h后,用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經肝門靜脈取血5 mL，靜置4 h，1 500 r/min離心30 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后用于實驗。

1.2.4 大鼠前脂肪細胞的培養 取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒，pH 7.2緩沖生理鹽水 (PBS)洗滌后剪成0.5～l mm3大小均勻的小顆粒，以1 000 r/min離心10 min取上層的純脂肪顆粒，輕輕鋪于經培養液潤濕的培養瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培養液5～10 mL，塞緊瓶塞，將底面翻轉朝上。37℃、5%C02培養1～2 h，待粘附牢固后，翻轉培養瓶做正常培養每日觀察。原代培養區域性單層匯合達到約1/2瓶底面積后即可傳代，取培養7代以內的大鼠前脂肪細胞用于實驗[3]。

1.2.5 按馬瑾瑜等[4]的方法測定 可見前脂肪細胞約在第2.5天時數量增加到20 000，在第9天前細胞基本呈現等比增長，其倍增時間約為2.5 d左右。

1.2.6 酶組織化學提取法測定大鼠前脂肪細胞分化過程中的標志物甘油磷酸脫氫酶(GPDH)動態變化 根據Stuart等[5]的方法進行測定，傳代細胞形成單層匯合后，在胰島素10 μmol/L和地塞米松1 μmol/L的作用下即開始上升并迅速增加，10 d左右到達高峰并維持在高水平。形態上表現為單層匯合1周后，細胞內出現大量脂滴。

1.2.7 油紅O染色提取法測定脂肪細胞內脂肪含量 用PBS沖洗2～3次，加入10%的甲醛緩沖液室溫下固定1 h，去固定液，加入油紅O染色，室溫下染色2 h，去染色劑，以無菌雙蒸水沖洗2次，洗去未著色的染料，倒置顯微鏡下觀察，照相。結束后，以異丙醇溶解，490 nm酶標儀下測吸光度，則可見前脂肪細胞內的脂肪含量在單層形成6～7 d后迅速增加，11 d左右到達高峰，與形態學上的單層匯合后1周左右細胞內出現脂肪顆粒完全吻合。細胞內脂肪含量的增加比GPDH的出現要晚約6 d左右。說明酶的出現在先，脂肪出現在后。

1.2.8 細胞分組及給藥 將第四代的大鼠前脂肪細胞接種到96孔板，貼壁后于96孔培養板每6孔一組，分為4組：空白對照組（含10%空白大鼠血清），六味地黃方超微飲片含藥血清高、中、低劑量組 （濃度分別為10%、5%、2.5%，簡稱超微高、中、低劑量組），上述各組所含血清的終濃度均為10%，含藥血清含量不足者以空白大鼠血清補齊。

1.2.9 六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞增殖的影響 配制大鼠前脂肪細胞增殖培養液:DMEM/低糖+空白大鼠血清,分別與六味地黃方超微飲片含藥血清共同溶解于培養液中,其終濃度同“1.2.8”項。取第四代的大鼠前脂肪細胞以10 000個/孔接入96孔培養板中,37℃5%C02培養12 h，分別加入上述配制的各種含藥培養液,再培養48 h，將濃度為5 g/L MTT液與10%空白大鼠血清的DMEM培養液按體積1∶9配成MTT培養液,移出培養液,換上MTT培養液培養4 h，吸干培養液,每孔加100 μL DMSO混勻后置酶標儀490 nm觀測吸光度值,觀察各濃度含藥血清對前脂肪細胞增殖的影響，測定并記錄各孔吸光度(A值)，6復孔取平均值。

1.2.10 六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞分化過程中甘油磷酸脫氫酶(GPDH)的影響 配制大鼠前脂肪細胞分化培養液：DMEM/低糖+空白大鼠血清+胰島素10 μmol/L+地塞米松1 μmol/L.以分化培養液配制不同濃度六味地黃方超微飲片含藥血清培養液，其終濃度同“1.2.8”項。取第四代的細胞以30 000個/孔接種入96孔培養板中，37℃、5%CO2培養5 d，分別加入上述配制的各培養液，再培養5 d，培養結束后,酶組織化學提取法測定GPDH的活性，紫外分光光度計340 nm波長處觀測吸光度值，實驗以吸光度（A值）間接表示酶的活性，測定并記錄各孔吸光度(A值)，6復孔取平均值。

1.2.11 六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪積聚的影響 取第四代的大鼠前脂肪細胞以30 000細胞/孔接種入96孔培養板中，于37℃、5%CO2培養10 d后，加入“1.2.10”配制好的含藥培養液，再于同樣條件下培養5 d，培養結束后,細胞用10%的甲醛固定1 h，用油紅O工作液(2 g/L)染色2 h，用雙蒸水充分洗凈，培養板放入37℃溫箱使殘余水分蒸發，用異丙醇溶解細胞內油紅O，置酶標儀510 nm觀測吸光度(A值)，記錄各孔吸光度(A值)，6復孔取平均值。

1.3 統計學分析

數據采用SPSS 14.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以“±s”表示，t檢驗。

2 結果

2.1 六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞增殖、分化過程中甘油磷酸脫氫酶（GPDH）的影響

六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞增殖的影響中10.0%、5.0%、2.5%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異均有統計學意義 （P＜0.05）。六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞分化過程GPDH的影響中10.0%、5.0%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；2.5%的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞增殖有促進作用，其它各組比較，其增殖A值隨濃度增大而升高。對大鼠前脂肪細胞分化過程中GPDH的升高有抑制作用，且在高濃度時抑制作用最強。見表1。

表1 六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞增殖、分化過程中GPDH的影響 （n=6，±s）

表1 六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞增殖、分化過程中GPDH的影響 （n=6，±s）

注：與空白對照組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別空白對照組超微高劑量組超微中劑量組超微低劑量組含藥血清濃度（%）—10.0 5.0 2.5增殖(A值)0.22±0.031 0.42±0.056△△0.35±0.045△△0.28±0.044△分化GPDH(A值)0.55±0.093 0.35±0.074△△0.43±0.057△0.50±0.045

2.2 六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪積聚的影響

六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪積聚的影響中,10.0%、5.0%濃度的六味地黃方超微飲片含藥血清與空白血清比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示六味地黃方超微飲片高、中劑量組對分化過程中脂肪積聚均有抑制作用，但低劑量組無此作用。見表 2。

表2 六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪積聚的影響 （n=6，±s）

表2 六味地黃方超微飲片含藥血清對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪積聚的影響 （n=6，±s）

注：與空白對照組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 討論

實驗結果表明六味地黃方超微飲片對大鼠前脂肪細胞的增殖具有促進作用，對其分化過程中的脂肪分解具有抑制作用，從而減少游離脂肪酸的排放，減少脂肪顆粒的積聚，提示此作用可能為六味地黃丸治療脂肪肝、糖尿病等代謝性疾病的機制之一。對研究六味地黃方在臨床糖尿病、糖耐量異常、高血壓、高血脂及動脈粥樣硬化等代謝性疾病[5]的治療機制有很好的促進作用。

中藥超微飲片具有質量可控、安全有效、服用方便、節省藥材的優勢。中醫超微飲片實施大規模工業化生產，為近年中藥現代化研究的一個熱點。本研究在參考有關方法的基礎上，將單味藥材超微飲片按比例混合，給大鼠灌胃，取其含藥血清，以大鼠前脂肪細胞為研究對象，觀察六味地黃方超微飲片含藥血清對脂肪細胞增殖、分化的影響[6]。研究發現，該作用與藥物的血清濃度高、低有關，但其機制如何？且與其湯、丸相比對脂肪細胞增殖、分化作用有何差異；同時該藥物的含藥血漿有無此作用，還有待進一步研究。

[1]蔡光先，楊永華.中藥飲片改革的新探索-單味中藥超微速溶飲片[J].湖南中醫雜志，2001，17（6）:21-22.

[2]王秋娟.六味地黃煎劑研究：全丸及拆丸對小鼠耐缺氧與降血脂的作用[J].中國藥科大學學報，1990，21(4)：241.

[3]朱曉海，何清濂.人前脂肪細胞培養及增殖與分化模型的建立[J].中華整形外科雜志，1999，15(3)：199-201.

[4]馬瑾瑜，顧映紅，余竹元.用快速比色計量法測定細胞生長[J].上海醫科大學學報，1993，20（4）：309-311.

[5]Stuart J， SimPson J.Dehydr0genase enzyme cyt0chemistry 0f unfixed leucocytes[J].J C1in Path，1970，（23）：517-521.

[6]肖子曾，戴 冰，劉 磊，等.六味地黃丸對大鼠前脂肪細胞增殖與分化的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2007，14（10）：22-24.