油菜籽多酚的分布及加工過程對菜籽多酚含量的影響

劉 琴，吳 梨，石嘉懌，鞠興榮*

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003)

油菜籽多酚的分布及加工過程對菜籽多酚含量的影響

劉 琴，吳 梨，石嘉懌，鞠興榮*

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003)

對油菜籽殼粕和脫殼后的菜籽肉粕中提取液的總酚含量、對DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力進行比較，并采用液質聯用法對提取液中的主要成分進行鑒定，對其中的芥子酸和芥子堿進行定量分析。結果表明：菜籽肉粕提取液中的總酚含量、對DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化能力約為菜籽殼粕中的兩倍，芥子酸和芥子堿的含量分別為菜籽殼粕中的約2.5倍和1.5倍。通過對實驗室溶劑除油的菜籽粕與工業高溫粕比較發現，高溫榨油過程會使菜籽的總酚含量、抗氧化性、芥子酸和芥子堿含量有所下降，其中總酚含量下降了12.06%，DPPH自由基和FRAP抗氧化值分別降低10.0%和5.6%，芥子酸和芥子堿含量分別下降了5.6%和21.12%。

油菜籽；多酚；抗氧化性；液質聯用；芥子堿；芥子酸

Abstract：Six binary solvent systems were used to extract industrial high-temperature rapeseed meal (a byproduct of rapeseed oil extraction at a temperature ranging from 110 to 115 ℃ after steaming at 115 ℃), and a mixture of ethanol and 1 mol/L HCl(7:3,V/V) was the selected solvent system for further studies in view of higher extraction efficiency, DPPH radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant power (FRAP) as well as environmental friendship. The following studies included comparisons on total polyphenol content, DPPH radical scavenging activity and FRAP value among the extracts from the residues left after oil extraction from rapeseed shell and kernel, solvent extraction-derived rapeseed meal and industrial hightemperature rapeseed meal, HPLC-MS/MS identification of major components of the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal and quantification of sinapine and sinapic acid in it. The total polyphenol content, DPPH radical scavenging activity and FRAP value of the extract from the residue left after oil extraction from rapeseed kernel were all approximately 2-fold higher than those of the extract from rapeseed shell with oil extraction and the contents of sinapic acid and sinapine exhibited approximately 2.5- and 1.5-fold increases, respectively. The comparison between solvent extraction-derived rapeseed meal and industrial high-temperature rapeseed meal indicated that during high-temperature oil extraction, total polyphenol content,DPPH radical scavenging activity, FRAP value and the contents of sinapic acid and sinapine decreased by 12.06%, 10.0%, 5.6%,5.6% and 21.12%, respectively.

Key words：rapeseed；polyphenol；antioxidant activity；HPLC-MS/MS；sinapine；sinapic acid

油菜是世界上僅次于大豆的第二大油料作物，也是我國產量最大的油料作物，年產量超過1000萬t，近兩年出現了產量持續增長的趨勢。菜籽粕是菜籽油加工的主要副產品，但由于其中含有硫代葡萄糖苷、植酸、單寧等多酚類物質，使其開發利用受到一定限制，長期以來只能作為低價的飼料或者肥料使用。經過三系雜交及基因工程育種培育出來的新菜籽品種“雙低”菜籽品種使得菜籽中的有毒成分硫代葡萄糖苷和芥酸的含量顯著降低，而得以廣泛種植[1]。但B.napus系中控制芥子堿含量的基因穩定，所以菜籽粕中仍有較高含量的多酚存在[2]。多酚的存在使得由菜籽粕加工的產品如菜籽蛋白、菜籽肽等具有苦澀味并影響蛋白質的吸收，因此菜籽粕副產品加工過程中菜籽多酚的去除是其中的步驟之一。然而，多酚類化合物普遍具有的抗氧化作用、抑菌作用又使得菜籽多酚具有作為天然抗氧化劑或抑菌劑的潛在應用價值。

嚴奉偉等[3-4]圍繞菜籽多酚的提取、分離、純化和活性評價進行了一系列的研究，但未見對提取出來的多酚化合物進行進一步的鑒定和分析的報道。國外已有大量的數據表明菜籽中的主要多酚物質是芥子堿、芥子酸及其衍生物[5-6]，并對不同基因品種中的菜籽多酚的含量進行了研究[7-8]，但是目前我國還沒有這些數據的報道。多酚類化合物在植物中的含量與基因品種、環境和氣候條件都有關系[5]。為了研究菜籽多酚在菜籽粕副產品加工過程中潛在的利用價值，對我國產的油菜籽中多酚的分析也是必不可少的。

本研究通過用不同的溶劑對菜籽殼粕、除殼后的菜籽肉粕、溶劑除油后的菜籽粕以及工業高溫粕提取液中總酚、清除DPPH自由基能力和FRAP值進行比較分析，并用HPLC-MS結合MS-MS的方法，對菜籽多酚的組分進行鑒定，對其中的主要組分芥子堿和芥子酸進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通市購菜籽(外觀黑色，產地江蘇)、高溫粕(菜籽經115℃蒸炒，再經110～115℃熱榨后，用6號溶劑浸提后的粕) 南京隆盛植物油脂有限公司。

芥子酸、Trolox(水溶性VE)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、2,4,6-三(2＇-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)Sigma-Aldrich公司；芥子堿硫氰酸鹽 北京銳鑫農科貿易有限公司；Folin-酚試劑(使用前稀釋10倍) 上海世澤生物科技；甲醇(色譜純) Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100HPLC-MSD(SL)高效液相色譜與質譜聯用儀(帶自動進樣器)、Zorbax S B2 C18反相色譜柱(4.6mm×150mm，5μm) 美國Agilent公司；Milli-Q Academic超純水系統 美國 Millipore公司；725型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；低溫高速冷凍離心機 上海飛鴿離心機廠；高速萬能磨碎機 天津泰斯特儀器有限公司；JLG45礱谷機 浙江黃巖糧儀廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

菜籽在礱谷機中碾壓去殼，得到分離的菜籽殼和菜籽肉，用高速粉碎機粉碎后，使用石油醚(40～60℃)用索氏提油裝置經12h抽提脫油，室溫下晾干除去溶劑后再次粉碎，分別過40目篩。高溫粕和帶殼菜籽粕在使用前按上述步驟同樣進行樣品處理。所有得到的原料均采用105℃恒質量法測定水分含量。

1.3.2 多酚的提取

取不同的菜籽粕樣品0.5g實驗，用10mL溶劑在25℃下振蕩萃取2h，離心后取上層清液用Folin-酚法測定總酚含量，DPPH法和FRAP法測定抗氧化性。剩余清液用旋轉蒸發儀蒸干后加5mL 50%的甲醇重新溶解后用HPLC-MS進行分析。實驗中所用到的相關溶劑及組成為：甲醇酸、乙醇酸、丙酮酸 (醇-酮與1mol/L HCl 體積比為7:3)；甲醇水、乙醇水、丙酮水 (醇-酮與水的體積比為7:3)。

1.3.3 總酚含量的測定

本實驗總酚的測定采用Folin-Ciocalteu法[9]。具體操作為：取0.4mL菜籽多酚提取液，加入3.9mL Folin-酚工作液，混合均勻5min后加入3mL 60g/L飽和碳酸鈉溶液，25℃條件下反應90min后于725nm 波長處測吸光度。用芥子酸做標準品，結果用芥子酸當量表示，即每克菜籽粕干質量相當于芥子酸的毫克數[9]。

1.3.4 抗氧化性測定方法

本實驗抗氧化性的測定方法參照Thaiponga 等[10]所用DPPH法和FRAP法。

1.3.4.1 FRAP法

TPTZ工作液的配制：取10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，0.3mol/L醋酸鈉緩沖液(pH3.6)25mL，20mmol/L的FeCl3溶液2.5mL混合均勻后置于35℃水浴中孵化30min后使用，即用即配。測定時取菜籽多酚提取液0.1mL，加入TPTZ工作液0.9mL，于35℃水浴中反應30min，593nm波長處測吸光度。以硫酸亞鐵溶液作標準曲線，抗氧化能力表示為硫酸亞鐵當量(mmol/g)，即每克菜籽粕FRAP抗氧化能力相當于FeSO4毫摩爾數。

1.3.4.2 DPPH法

具體操作為，取稀釋一定倍數的提取液0.1mL，加入3.9mL 0.1mmol/L的DPPH溶液，于25℃水浴反應60min，于515nm波長處測其吸光度，用水溶性VE做標準品， 結果用Trolox當量表示(mmol/g)，即每克菜籽粕干質量對DPPH自由基清除能力相當于Trolox的毫摩爾數。

1.3.5 用HPLC-MS結合MS-MS對菜籽多酚提取液的分析

將 10μL的提取液由自動進樣器進樣，經HPLC分離后導入質譜分析儀進行分析，在分析中采用的液相色譜條件為：以含0.1% HAc 的水為流動相A，含0.1%HAc的甲醇為流動相 B，控制流速為 0.5mL/min，柱溫為 25℃，按照如下梯度洗脫：0～10min，10%～30%B；10～30min，30%～40% B；40～50min，40%～60%B；50～55min，100% B；55～65min，100%～10% B；65～70min，10% B。采用DAD檢測器，檢測波長為190～400nm。

質譜條件：霧化氣(N2)30Psi ；干燥氣(N2)10mL/min；毛細管溫度為350℃，毛細管電壓為在正離子模式下采用3.5kV，負離子模式下為3.0kV。在芥子堿分析時采用正離子模式，其他組分的分析為負離子模式。

對菜籽多酚提取液中的芥子酸與芥子堿定量分析分別以芥子酸和芥子堿硫氰酸鹽為標準物質。在波長320nm波長處按峰面積進行分析。在上述液相條件下，芥子酸在含量5～25μg/mL范圍內得到的標準曲線為：A=31.232B－8.8008(R2=0.9985)，芥子堿在50～200 μ g/mL范圍的標準曲線為：A=18.467B－28.34(R2=0.9994)，式中A為吸光度，B為質量濃度(μg/mL)。

1.4 統計分析

所得數據均為3次平行測定的平均值，并用SPSS16.0對測定數據進行ANOVA 及多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 高溫菜籽粕不同溶劑提取液的總酚含量及抗氧化性比較

表1 不同溶劑提取液中總酚含量和對DPPH自由基的清除能力及FRAP值Table 1 Total polyphenol contents (TPCs), DPPH radical scavenge capacities and FRAP values of different solvent extracts from industrial high-temperature rapeseed meal

由表1可知，在實驗所采用的6種提取溶劑中，酸化后的溶劑所得到提取液中總酚含量，對DPPH自由基清除能力和FRAP值均明顯高于不含酸的提取劑(P＜0.05)，其中丙酮酸提取液中總酚和抗氧化能力最高，乙醇酸其次，甲醇酸略低于乙醇酸。總酚含量與DPPH自由基清除能力和FRAP值均顯著相關(P＜0.05，r分別為0.944和0.939)。從提取效率和環境友好性考慮，在后續實驗中，均采用乙醇酸作為提取劑。

2.2 菜籽不同組成部分的乙醇酸提取液中總酚含量及抗氧化能力的比較

通過上述提取劑優化實驗，選擇乙醇酸對除油后的菜籽殼、脫殼菜籽肉和菜籽粕(不經過脫殼處理)以及工業高溫粕樣品用上述方法進行提取，并對提取液中總酚含量和抗氧化能力進行比較，結果見表2。

表2 菜籽殼粕、脫殼菜籽肉粕、高溫粕、菜籽粕提取液中總酚含量和DPPH自由基清除能力及FRAP值Table 2 TPCs, DPPH radical scavenge capacities and FRAP values of the extracts from different residues after rapeseed oil extraction

由表2可知，脫殼菜籽肉粕中的總酚以及抗氧化性顯著高于菜籽殼粕(P＜0.05)，脫殼菜籽肉粕多酚的含量約為菜籽殼粕中的兩倍，而提取液清除DPPH自由基的能力和FRAP抗氧化性也為菜籽殼粕提取液的近兩倍。實驗室除油后的菜籽粕的總酚含量和抗氧化性明顯高于高溫粕(P＜0.05)。總酚含量與DPPH自由基清除能力和FRAP值顯著相關(P＜0.05)，r分別為0.997和0.965。

2.3 菜籽中多酚結構的鑒定

為了全面的分析菜籽中的多酚種類，本實驗對實驗室溶劑除油后的菜籽粕的乙醇酸提取液用HPLC-MS結合MS-MS進行了分析。圖1是該提取液在320nm波長處的液相色譜圖，在菜籽多酚直接提取液中，有8個比較明顯的峰，它們的保留時間、對應的質譜峰以及二級質譜產生的碎片峰見表3。

圖1 菜籽粕乙醇酸提取液的HPLC液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram recorded at 320 nm of the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal

表3 菜籽粕乙醇酸提取液中主要組分的保留時間、對應的質譜峰、二級質譜碎片峰及對應的化合物Table 3 Mass spectral data of the major components in the extract from solvent extraction-derived rapeseed meal

從圖1可以看出，峰1是菜籽提取液中的主要組分，在負離子模式下未能檢測到該組分的質譜峰，在正離子模式下該峰的m/z值為310.2，即相對分子質量為309.2，與芥子堿一致，該組分的保留時間和紫外吸收光譜也與芥子堿(圖2)一致。而二級質譜顯示的碎片峰m/z為251.2，即為芥子堿失去一個季胺基碎片(－59)所得，由此確定峰1為芥子堿[11]。

圖2 芥子酸與芥子堿紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of sinapic acid and sinapine

峰2和3的m/z均為385.2，它們的MS-MS其中一個碎片峰為223.1，與芥子酸的m/z一致，該值與母離子385.2相差162，為典型的葡萄糖苷鍵斷裂(圖3結構式)，故該兩個組分均為芥子酸糖苷，另一個碎片峰205.1為芥子酸失去一個水而產生的。出現兩個峰保留時間不一樣說明與芥子酸相連的葡萄糖具有不同結構，互為異構體。峰4的m/z為561.2，對應的二級質譜碎片峰有432.2和208.2，目前還無法由質譜確定該組分的組成。峰5和峰6所對應的m/z均為223.1， 所對應化合物的相對分子質量為224.1，與芥子酸一致。它們的二級質譜對應的碎片峰m/z均為208.0、179.0和164.0。根據碎片判斷，碎片208為從母離子223.1中失去了一個甲基而產生，碎片179.0為母離子失去了一個羧酸根而產生；而164為從母分子中失去一個甲基和一個羧酸根而產生，與芥子酸的結構相吻合。不同點為：在相同的撞擊能量下，峰5所對應碎片峰中強度最大的為164.0，而峰6為208.0，標準品順式芥子酸的保留時間與和碎片與峰6相同，所以峰5對應的可能是反式芥子酸。峰7的m/z為751.1，所得二級質譜碎片峰主要為529.1和223.1，該組分的分子質量和碎片均與文獻[12]報道的二芥子酸龍膽二糖苷一致，根據化合物的結構，碎片m/z為529的產生為母離子失去一個中性的芥子酸，而223的產生為母離子失去一個芥子堿龍膽二糖苷(sinapoylglucose)產生的。峰8(m/z591.1)的二級碎片峰367.1和223.1，該峰與文獻[12]所報道的二芥子酸葡萄糖苷一致，其碎片也與該結構吻合：碎片m/z367.1為母離子591.1失去一個中性芥子酸(224)而得到，而碎片m/z為223.1為母離子失去芥子酸葡萄糖苷而得到。

圖3 芥子堿(a)、芥子酸(b)和芥子酸葡萄糖苷(c)的結構式Fig.3 Structures:(a) sinapine; (b) sinapic acid; and (c)sinapoylglucoside

2.4 菜籽不同組成部分的的芥子酸和芥子堿的定量分析以及加工對其含量的影響

由HPLC-MS和MS-MS的結果分析可以得出，菜籽中可溶性多酚提取液主要的成分為芥子堿和芥子酸的衍生物，于是對菜籽不同部位殼和肉中的芥子酸和芥子堿的含量進行比較，同時將高溫粕和實驗室除油處理的菜籽粕進行比較，結果如表4所示。

表4 菜籽殼粕、脫殼菜籽肉粕、高溫粕和菜籽粕中芥子堿和芥子酸的含量Table 4 Contents of sinapine and sinapic acid in different residues after rapeseed oil extraction

由表4可知，菜籽粕中芥子堿的含量遠遠大于芥子酸的含量(P＜0.05)，實驗室除油后的菜籽粕和脫殼菜籽肉粕中的芥子堿的含量達到了芥子酸含量的10～20倍以上。另外從菜籽殼粕和脫殼菜籽肉粕中的含量的對比可以看出，芥子堿在殼粕和肉粕中的含量顯著不同(P＜0.05)，在肉粕中芥子堿的含量是殼粕的約2.5倍，而高溫粕中的芥子堿含量比實驗室溶劑除油的菜籽粕中大約下降了22%，這說明高溫加工過程會對芥子堿產生影響。芥子酸同樣是在肉粕里的含量大于殼里的含量，但不像芥子堿差別那么大，另外，盡管在高溫下會被氧化，但是高溫粕中的芥子酸的含量與實驗室的除油后的粕中的含量并無明顯不同，這可能是由于芥子堿在高溫氧化下分解而產生一部分芥子酸，使得最后芥子酸的總含量并無明顯變化所致。

3 結 論

本實驗對菜籽多酚的不同提取劑的提取液中總酚和抗氧化性進行比較研究，結果表明：乙醇酸和丙酮酸對菜籽多酚的提取率最高，通過總酚和抗氧化性測定表明，脫殼菜籽肉粕中多酚乙醇酸提取液中的總酚含量和抗氧化性都明顯高于菜籽殼粕的多酚提取液，大約為殼粕中的兩倍。高溫壓榨過程會使菜籽總酚含量和抗氧化性都有所下降。通過對多酚提取液的HPLC-MS結合MSMS分析，發現菜籽多酚提取液主要是芥子堿、芥子酸以其衍生物，其中芥子堿為最主要成分，在菜籽粕中含量11.45mg/g，占質量百分比的1.108%，在高溫粕中的含量為8.63mg/g，占質量百分比的0.863%；同時在脫殼菜籽肉粕中含量為14.043mg/g，占質量百分比1.4%，是殼中含量的2.5倍以上。芥子堿廣泛分布與十字華科植物如萊菔子、白芥子等十字花科植物中，也是一些中藥活性成分[13]。近代醫學表明芥子堿具有抗菌、降壓、抗衰老作用以及具有明顯的抗輻射作用[14-15]，因此在菜籽粕中的高含量的芥子堿意味著菜籽多酚提取液作為一種加工副產品也具有一定的應用潛力。

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Distribution of Polyphenols in Rapeseed Shell and Kernel and Effect of Oil Extraction Methods on Their Content in Rapeseed Meal

LIU Qin，WU Li，SHI Jia-yi，JU Xing-rong*
(Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

O625.31

A

1002-6630(2010)19-0033-05

2010-05-10

國家“863”計劃項目(2007AA10Z331)

劉琴(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為功能食品化學。E-mail：liuq_s@yahoo.com

*通信作者：鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，研究方向為糧油深加工技術。E-mail：xingrongju@163.com