響應面優化超聲波提取山毛豆抑菌物質條件研究

胡林子，蔣 雨，馬永全，于 新,*

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

響應面優化超聲波提取山毛豆抑菌物質條件研究

胡林子1,2，蔣 雨3，馬永全2，于 新2,*

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

考察料液比、提取時間、提取溶劑對超聲波法提取山毛豆種子中抑菌物質的影響。在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法對山毛豆抑菌物質的提取工藝進行優化。結果得到山毛豆抑菌活性物質的最佳提取工藝條件為液料比12:1(mL/g)、乙醇體積分數55%、超聲波提取52min。該條件下質量分數為20%的山毛豆提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為20.24mm，與理論最優值20.70mm接近。

山毛豆種子；超聲波提取；抑菌活性；響應面法；工藝條件

Abstract：Ultrasonic wave was applied for extraction of effective component fromTephrosia vogeliiHook f. seeds. Effects of liquid/material ratio, extraction time and ethanol concentration on the antimicrobial effect of the extract were investigated. On the basis of single factor tests, the method of response surface analysis (RSA) with three factors and three levels was adopted.Results showed that the optimum conditions were as follows:liquid-to-material ratio 12:1 mL/g, the ethanol concentration 55%and the ultrasonic processing time 52 min. Under these conditions, the inhibition zone of 20% original concentrated extract forStaphlococcus aureusreached up to 20.24 mm, which was in close agreement of the predicted value(20.70 mm).

Key words：Tephrosia vogeliiHook f. seeds；ultrasound-assisted extraction；antimicrobial activity；response surface methodology；technological conditions

非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f.)又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉，屬豆科，蝶形花亞科，灰葉屬，多年生灌木，是一種優良的水土保持、荒坡綠化、土壤改良植物[1-3]。非洲山毛豆種子含有粗脂肪13.47%(m/m)，其中，不飽和脂肪酸的含量達66.94%(m/m)，粗蛋白含量38.73%(m/m)，是潛在的食品與飼料優質資源[4]。非洲山毛豆含有魚藤酮類化合物，是一種優良的殺蟲植物，其殺蟲活性的發現、研究和應用在國內外已有70多年歷史[5]，前人研究了非洲山毛豆葉、莖提取魚藤酮類物質作為生物殺蟲劑使用，效果良好，但是對于山毛豆種子、葉莖提取物的抑菌作用的研究尚未見研究報道。應用超聲技術來強化提取過程，可有效提高提取效率，縮短提取時間，節約成本，甚至還可以提高產品的質量和產量。目前超聲提取技術己在對某些天然植物的提取中得到了工業化應用[6-7]。本實驗用響應面分析法(RSM)優化超聲波輔助提取非洲山毛豆種子的抑菌活性物質的工藝條件，旨在為山毛豆資源的利用及天然抑菌劑的開發提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山毛豆種子，采自廣州市花都區北興鎮山坡(北緯23°27′，東經113°26′)；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 華南農業大學食品微生物實驗室；乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphiB. CMCC50094) 廣東省微生物研究所；培養基為牛肉膏蛋白胨培養基。

無水乙醇、N a O H、H C l、瓊脂、N a2HPO4、NaH2PO4、NaCl(均為分析純)；牛肉膏、蛋白胨(均為生化試劑)。

1.2 儀器與設備

MJ-176NR型多功能粉碎機 日本松下電器產業株式會社；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱 廣東環凱微生物科技有限公司；R系列旋轉薄膜蒸發儀 無錫星海生化設備有限公司；電熱恒溫培養箱 上海索普儀器有限公司；SW-CJ-IF型無菌超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；KQ5200型超聲波清洗器 廈門中村光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制備

除去雜質的山毛豆，粉碎過40目篩，取100g。稱樣置于燒杯中，加入提取劑，于50W的超聲條件下輔助浸提，4層紗布過濾，真空抽濾，用旋轉薄膜蒸發儀在60℃減壓濃縮，得黑紅色黏稠物10mL，0～4℃儲存備用。

1.3.2 試驗方案

以不同液料比、超聲波處理時間、提取劑濃度為因素，以抑菌圈直徑為指標，根據單因素確定顯著水平，在此基礎上，選擇一種菌作為指示菌，采用Design Expert 7.0統計分析軟件的響應面分析法設計試驗，以獲取最適工藝參數[8]。

1.3.3 抑菌效力的測定

1.3.3.1 菌懸液制備

在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養基，37℃培養24h，挑取菌落，用無菌生理鹽水稀釋，獲得1.0×106～1.0×107CFU/mL的菌懸液，備用[9]。

1.3.3.2 提取物抑菌作用的測定

用無菌水將山毛豆提取物稀釋至20%(V/V)。采用管碟法[10]，取無菌培養皿(直徑90mm、高18mm)，每皿加入2%的瓊脂作底層。在培養基內等距離分散放置兩個牛津杯(內徑6mm，外徑8mm，高10mm)，將菌懸液加入到溫度適宜的培養基中，混勻后迅速倒入培養皿，每皿約倒培養基15mL，靜置20min后待培養基凝固取出牛津杯，用移液槍分別移取樣品溶液150μL加入到平板杯孔中，每個菌種每種提取物做4組平行，以與稀釋試樣含同樣濃度的乙醇為空白對照。37℃培養12h，用直尺以十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值，記錄結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對提取物抑菌效果的影響

以50%乙醇為溶劑，一次性提取，液料比分別為5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL/g)，超聲提取40min，結果見圖1。在液料比5:1～15:1(mL/g)范圍內，山毛豆提取物抑菌作用呈增強趨勢；當液料比大于15:1(mL/g)時，呈緩慢減弱的趨勢。因此，較佳的液料比介于10:1～15:1(mL/g)。

圖1 液料比對抑菌效果的影響Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio on antibacterial activity of extract

2.1.2 提取時間對提取物抑菌效果的影響

在提取劑為50%乙醇，液料比10:1(mL/g)的條件下，超聲提取20、40、60、80、100、120min，提取液抑菌結果見圖2。

圖2 超聲波提取時間對抑菌效果的影響Fig.2 Effects of ultrasound processing time on antibacterial activity of extract

山毛豆提取物的抑菌效果隨著超聲提取時間的延長呈先增強后減弱的趨勢，這主要是由于開始時原料和溶劑之間的濃度差比較大，擴散速度快，有效抑菌成分浸出速度也快，但隨著時間延長，一方面溶劑的揮發，另一方面非抑菌成分的溶出，造成了山毛豆提取物抑菌效果的下降。因此，選取40min為最佳超聲波提取時間。

2.1.3 乙醇體積分數對提取物抑菌效果的影響

液料比10:1(mL/g)，乙醇體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，超聲提取40min。提取物抑菌效果見圖3。

圖3 乙醇體積分數對抑菌效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on antibacterial activity of extract

在其他條件相同的情況下，當乙醇體積分數介于30%～50%時，山毛豆提取物的抑菌效果隨乙醇體積分數的增加而明顯增強。當乙醇體積分數大于50%時，抑菌效果隨體積分數的增加而顯著減弱。因此，選取50%左右為提取溶劑的最佳體積分數。

2.2 響應面法優化試驗

2.2.1 試驗設計及模型分析

依據Design Expert 7.0軟件，采用Central Composite Design建立數學模型[11]，以液料比(X1)、浸提時間(X2)、乙醇體積分數(X3)值為自變量，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長，因子編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定抑菌圈直徑，重復3次，取平均值為響應值(Y)，測定結果見表2。

表2給出了山毛豆提取物的抑菌試驗結果及其預測值。依據Design Expert 7.0軟件中的Central Composite Design方法，以液料比、超聲提取時間、乙醇體積分數為因素設計響應面試驗，對試驗設計中各組提取物的抑菌效果進行回歸分析，得回歸方程為：

式中：Y為抑菌圈的預測值；x1～x3分別為上述3個自變量的編碼值。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

對模型進行方差分析(表3)、模型系數顯著性檢驗(表 4)。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

從該方程的方差分析(表3)可知，本試驗所選模型不同處理間差異極顯著(P＜0.0001)，說明回歸方程應變量與全體自變量之間的相關關系是顯著的，即這種試驗方法是可靠的；失擬項P=0.3767＞0.05，失擬項差異不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，可以用該方程對不同提取條件下的抑菌效果進行預測。本試驗中，變異系數較低(2.78%)，說明了試驗可靠性強；模型的校正決定系數，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。該模型的信噪比(RSN)為16.094，遠大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對提取物的抑菌效力進行預測?？梢杂么四Ｐ蛯Τ暡ㄌ崛∩矫挂志煞值墓に囘M行優化和預測。

表4 回歸方程模型系數的顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression coefficient

由表4可知，模型一次項x2(P＜0.0001)差異極顯著，x3(P=0.0232)差異顯著，x1(P=0.1320)差異不顯著；二次項差異極顯著；交互項x1x2(P=0.0161)差異顯著，x1x3(P=0.0021)差異極顯著，x2x3(P=0.2960)差異不顯著。表明超聲時間、乙醇體積分數對山毛豆提取物抑菌效應影響顯著，且在液料比與超聲時間、液料比與乙醇濃度之間存在交互作用。x1、x2、x3系數估計值分別為－0.23、1.27、0.37，影響因素主次順序為時間＞乙醇體積分數＞液料比。

2.2.2 響應面分析與優化

圖4 液料比、時間對抑菌效力影響的響應面Fig.4 Response surface showing the effect of liquid/material ratio and time on antibacterial effect of the extract

模型的響應面圖解結果見圖4～6。各圖表示Xl、X2、X3中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對提取物抑菌能力的影響[12-13]。從圖中可知，液料比和乙醇體積分數的交互作用相對其他因素之間的交互作用最大，而時間和乙醇體積分數之間的交互作用最小。

圖5 液料比、乙醇體積分數對抑菌效力影響的響應面Fig.5 Response surface showing the effect of liquid-to-material ratio and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

圖6 時間、乙醇體積分數對抑菌效力影響的響應面Fig.6 Response surface showing the effect of time and ethanol concentration on antibacterial effect of the extract

用Design-Expert軟件對試驗模型進行典型性分析，以獲得最優的提取條件。經分析，X1、X2、X3最適值分別為12.08mL/g、52.18min、55.05%，理論抑菌圈直徑為20.7014mm。

2.3 最優條件的驗證

將提取條件修正為液料比12:1(mL/g)、提取時間52min、乙醇體積分數55%，以驗證響應面法優化條件的可靠性。在優化條件下，重復實驗5次，取平均值。實驗測得抑菌圈直徑為20.24mm，與模型預測值相差2.23%。證明該模型具有一定的可靠性。

3 結 論

采用超聲波提取技術對山毛豆抑菌活性物質進行了提取，通過單因素試驗和響應面分析對超聲波提取工藝進行優化，結合實際可操作性得出較優工藝條件為液料比12:1(mL/g)，提取時間52min、乙醇體積分數55%。該條件下的山毛豆提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑為20.24mm，與模型預測值接近。

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Ultrasound-assisted Extraction of Antimicrobial Substances fromTephrosia vogeliiHook f. Seeds

HU Lin-zi1,2，JIANG Yu3，MA Yong-quan2，YU Xin2,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)22-0091-05

2010-01-11

胡林子(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白質工程。E-mail：hulinzi-lny@163.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn