乳化對(duì)天然番茄紅素萃取物在雄性大鼠體內(nèi)生物接近度的影響

惠伯棣，李 京，張一琳

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083；2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100037)

乳化對(duì)天然番茄紅素萃取物在雄性大鼠體內(nèi)生物接近度的影響

惠伯棣1，李 京2，張一琳1

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083；2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100037)

采用乳化與未乳化的天然番茄紅素萃取物配制成番茄紅素含量為0.263mg/mL(低劑量)、0.525mg/mL(中劑量)和1.575mg/mL(高劑量)的灌胃液。選用250g SD雄性大鼠30只分成3組，每組10只，每天一次灌胃1mL，收集大鼠24h內(nèi)的糞便。測(cè)定糞便中的番茄紅素含量，計(jì)算番茄紅素的生物接近度。乳化與未乳化物在大鼠體內(nèi)的生物接近度于第3天達(dá)到最大值；飼喂劑量增加可以降低乳化物與未乳化物的生物接近度；乳化可以提高番茄紅素的生物接近度。

番茄紅素；吸收；乳化

Abstract：Objective:To explore the effect of emulsification on the bio-accessibility of natural lycopene in male rats. Methods:Totally 30 SD male rats with body weight of 250 g were randomly divided into 3 groups for 10 in each group. The rats were administered emulsified natural lycopene solutions with final lycopene concentrations of 0.263, 0.525 mg/mL and 1.575 mg/mL,respectively once a day for 4 consecutive days. The amount of lycopene in feces collected within 24 h after each administration was determined and the bio-accessibility of natural lycopene was calculated. Results:The bio-accessibilities of emulsified and unemulsified lycopene reached their separate maximum values on the 3thday of administration; increasing administration amount resulted in a lower bio-accessibility of emulsified and un-emulsified lycopene. Conclusion:Emulsification is able to increase the bio-accessibility of natural lycopene.

Key words：lycopene；absorption；emulsification

番茄紅素是胡蘿卜素(carotene)的一種，分子式為C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為536.85。番茄紅素的分子由多聚烯鏈構(gòu)成，共含11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵，末端為開環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)。番茄紅素為脂溶性化合物，能溶于大部分有機(jī)試劑。其中，鹵代烷烴(如：二氯甲烷)是比較理想的溶劑[1]。

圖1 全反式番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of all-trans-lycopene

番茄紅素的資源有兩種：人工合成品和天然產(chǎn)物。這兩種產(chǎn)品在市場(chǎng)上有著激烈的爭(zhēng)奪。由于其生物學(xué)功能的差異，消費(fèi)群體有傾向天然產(chǎn)物的明顯趨勢(shì)。因此，對(duì)天然產(chǎn)物的研究具有更現(xiàn)實(shí)的意義。

番茄紅素是完整的類胡蘿卜素生物合成過程中的中間產(chǎn)物。番茄紅素被合成后，經(jīng)酶促反應(yīng)可轉(zhuǎn)化成γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和含氧的類胡蘿卜素。在番茄的果肉細(xì)胞中，番茄紅素的含量高、γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量卻很低，這是由于代謝體系中缺乏足夠的酶催化此類反應(yīng)[2]。

近二十年以來，隨著人們對(duì)高質(zhì)量生活的追求，對(duì)于具有多種防治疾病功能的天然活性物質(zhì)的研究與開發(fā)產(chǎn)生了極大的興趣。番茄紅素以其獨(dú)特的健康功能被人們所關(guān)注，主要包括：抗氧化功能和降低前列腺疾病風(fēng)險(xiǎn)的功能等[3]。

因此，人們對(duì)它在體內(nèi)的吸收也進(jìn)行了不少研究。已有的結(jié)論包括：1)熱加工過的番茄汁中的番茄紅素比未加工的易吸收；2)番茄紅素的血清濃度一般會(huì)隨著攝入量的增加而升高，但不呈線性關(guān)系；3)番茄紅素屬于脂溶性化合物，因此，它在體內(nèi)的吸收如果擁有脂環(huán)境，可提高其生物利用度；4)番茄紅素的吸收率會(huì)隨年齡增加而下降。這些研究的最終目的是探索提高番茄紅素在體內(nèi)生物利用度(即：進(jìn)入血液循環(huán)的劑量和速度)的途徑。其結(jié)果對(duì)提高現(xiàn)有食品中番茄紅素的生物利用度有顯著的參考價(jià)值[4-6]。

在本項(xiàng)研究中，以雄性大鼠為動(dòng)物模型，以來自番茄的天然番茄紅素為受試物，通過對(duì)大鼠糞便中的番茄紅素殘留量分析，探索乳化處理對(duì)番茄紅素到達(dá)小腸壁的劑量(以生物接近度描述)的影響。在此，番茄紅素到達(dá)小腸壁的劑量以生物接近度描述，見圖2。其結(jié)果對(duì)提高番茄紅素制品中番茄紅素的生物利用度有現(xiàn)實(shí)的意義。

圖2 番茄紅素在雄性大鼠體內(nèi)的生物接近度Fig.2 Bio-accessibility of lycopene in male rats

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用(250±2)g SD雄性大鼠30只，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK京2006-0008。

1.2 試劑

本項(xiàng)研究中使用的番茄紅素萃取物由新疆紅帆生物科技有限公司提供，該產(chǎn)品為番茄果皮的超臨界CO2流體萃取物，其主要組分見表1[7-8]。

大豆色拉油 本地超市；吐溫-60、丙酮(分析純)北京化工廠；大豆卵磷脂(純度為90%)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)、三乙胺(色譜純) 迪馬公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HPLC(Waters 1525溶劑輸送系統(tǒng)、PDA-996二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司；MultiSpec-1501分光光度計(jì) Shimadzu公司。

1.4 方法

1.4.1 天然番茄紅素萃取物乳化灌胃液的配制

在陰暗處，將天然番茄紅素萃取物置于研缽中，加熱到65℃加入色拉油研磨均勻，參照中國(guó)食品添加劑行標(biāo)(GB2760食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))，向混合物中加入0.25mg/mL的吐溫-60繼續(xù)研磨至完全均勻。將溫度降低至37℃，繼續(xù)向混合物中加入5g/mL的大豆磷脂，不斷研磨至均勻。參照J(rèn)ECFA于2006年在羅馬召開的第67次會(huì)議公布文件中推薦的ADI值，最終，配制成番茄紅素含量為0.263mg/mL(低劑量)、0.525mg/mL(中劑量)和1.575mg/mL(高劑量)的灌胃液。4℃保存。

1.4.2 天然番茄紅素萃取物灌胃液的配制

于陰暗處，將天然番茄紅素萃取物置于研缽中，加熱到65℃，加入色拉油，參照J(rèn)ECFA于2006年在羅馬召開的第67次會(huì)議公布文件中推薦的ADI值，配制成番茄紅素含量與乳化灌胃液相同的灌胃液，分別為0.263mg/mL(低劑量)、0.525mg/mL(中劑量)和1.575mg/mL(高劑量)的灌胃液，不斷研磨至均勻。4℃保存。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼喂和分組

灌胃前，30只大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中一周，所用飼料由北京奧科協(xié)力飼料有限公司提供，配方見表2。使用前，按1.4.7節(jié)所述方法對(duì)飼料中的番茄紅素進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)飼料中不含番茄紅素。待大鼠熟悉環(huán)境后隨機(jī)分成3組，每組10只。第1組灌喂天然番茄紅素萃取物乳化灌胃液，第2組灌喂天然番茄紅素萃取物灌胃液，第3組作為對(duì)照組灌胃色拉油。

1.4.4 灌胃

在灌胃前，將灌胃液在37℃下預(yù)熱30min，并攪拌均勻。每只大鼠每天灌胃一次，每次灌胃量1mL。第1組灌喂天然番茄紅素萃取物乳化灌胃液。第2組灌喂天然番茄紅素萃取物灌胃液。每組按照低、中、高劑量依次進(jìn)行灌胃，每個(gè)劑量連續(xù)灌胃4d，每個(gè)劑量灌胃實(shí)驗(yàn)之間間隔3d。第3組作為對(duì)照組，每只每日灌胃一次，每次灌胃色拉油1mL。

表1 番茄果皮萃取物的組成Table 1 Compositions of a commercially available tomato skin extract used in this study

表2 飼料配方Table 2 Formula of the feed for rats used in this study

1.4.5 糞便的收集

每次灌胃后將每只大鼠24h內(nèi)的糞便收集到培養(yǎng)皿中，用研缽搗碎，混合均勻，稱鮮質(zhì)量。在60～70℃下真空干燥4h，稱干質(zhì)量。記錄每只大鼠每次灌胃后24h內(nèi)的總糞便干質(zhì)量。

1.4.6 糞便中番茄紅素的萃取

稱取0.1g干燥糞便粉末，加少量丙酮(4倍，V/m)研磨，研磨后靜置，用滴管小心移出上清液，多次重復(fù)直至上清液為無色。合并收集上清液，用丙酮定容至15mL。實(shí)驗(yàn)過程中盡量避光。

1.4.7 灌胃液和糞便中的總類胡蘿卜素含量測(cè)定

用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)量樣品萃取液在474nm處的吸光度，并根據(jù)公式(1)計(jì)算灌胃液和糞便中的總類胡蘿卜素含量。

式中：x為樣品中所含組分的質(zhì)量/g；y為樣品溶液的體積/mL；A為樣品組分在474nm波長(zhǎng)處吸光度；A1%1cm為吸光系數(shù)，定義為在1cm光程長(zhǎng)的比色杯中1g/L質(zhì)量濃度溶質(zhì)的理論吸收值。在此采用值為ε=3400。

1.4.8 灌胃液和糞便中番茄紅素含量的測(cè)定

首先測(cè)定灌胃液和糞便中的類胡蘿卜素組成(CC)。其方法為：先根據(jù)1.4.7節(jié)所述方法測(cè)定樣品中總類胡蘿卜素的含量，再用高效液相色譜(HPLC)將樣品中的各類胡蘿卜素組分分離，根據(jù)其色譜行為和光譜特征對(duì)各組分進(jìn)行定性鑒定，根據(jù)在474nm波長(zhǎng)處所得色譜圖上番茄紅素組分峰的面積比計(jì)算樣品中番茄紅素的含量[9-10]。

HPLC條件：色譜柱：DiamonsilTM(4.6mm×25cm，5μm)；流動(dòng)相A：乙腈-水(9:1，V/V)；流動(dòng)相B：乙酸乙酯；線性梯度洗脫：B在15min內(nèi)由0%增加至100%；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：475nm；波長(zhǎng)收集范圍：260～700nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.4.9 生物接近度的計(jì)算

式中：C1為1mL灌胃液中番茄紅素的含量；C2為24h內(nèi)總糞便中番茄紅素的含量。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理

在計(jì)算每組大鼠糞便中番茄紅素的平均值時(shí)，取其中的6只所得數(shù)據(jù)計(jì)算，舍去離散程度較大的數(shù)據(jù)和負(fù)值。

2 結(jié)果與分析

與對(duì)照組相比，灌胃液中的天然番茄紅素萃取物和乳化過的天然番茄紅素萃取物對(duì)受試動(dòng)物的體質(zhì)量增加和排便量無顯著影響。

2.1 灌胃液的類胡蘿卜素組成

采用1.4.8節(jié)所述方法，對(duì)灌胃液的類胡蘿卜素組成進(jìn)行測(cè)定。圖3表明：灌胃液中被檢出的類胡蘿卜素種類有番茄紅素和β-胡蘿卜素。對(duì)圖3的積分結(jié)果表明：番茄紅素和β-胡蘿卜素的比例為：94.37:5.63。這個(gè)比例與表1中描述的天然番茄紅素萃取物的類胡蘿卜素組成相近。根據(jù)圖3所得結(jié)果，灌胃液中番茄紅素的含量為灌胃液的總類胡蘿卜含量(根據(jù)1.4.7節(jié)所述方法測(cè)定)與灌胃液中番茄紅素所占的比例之積。

圖3 灌胃液的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of gastric administration solution with unemulsified lycopene

2.2 糞便的類胡蘿卜素組成

采用1.4.8節(jié)所述方法，對(duì)糞便的類胡蘿卜素組成進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明：糞便中未檢出β-胡蘿卜素。灌胃液中的β-胡蘿卜素組分在消化道中發(fā)生了兩種可能的變化，一種全部被吸收，另一種為在消化過程中損失，或者二者并存。因此，在隨后的研究中，糞便中番茄紅素的含量測(cè)定采用糞便中總類胡蘿卜素含量的測(cè)定方法。

2.3 天然番茄紅素萃取物灌胃液的生物接近度

在本項(xiàng)研究的最初設(shè)計(jì)中，灌胃天數(shù)為3d，目的是計(jì)算每天的平均值。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察到：受試動(dòng)物在3d中對(duì)番茄紅素天然萃取物灌胃液的生物接近度呈上升趨勢(shì)，故在本實(shí)驗(yàn)中將灌胃實(shí)驗(yàn)的時(shí)間延長(zhǎng)至4d。

圖4 天然番茄紅素萃取物在雄性大鼠體內(nèi)的生物接近度變化Fig.4 Change in bio-accessibility of natural lycopene extract in male rats

圖4表明：1)番茄紅素天然萃取物在大鼠體內(nèi)的生物接近度3d處于上升趨勢(shì)。這一觀察可以被認(rèn)為是番茄紅素天然萃取物中存在促進(jìn)因子的證據(jù)之一。換言之，在3d內(nèi)，連續(xù)飼喂可以提高其生物接近度。2)番茄紅素天然萃取物在大鼠體內(nèi)的生物接近度變化在3d處呈現(xiàn)一極點(diǎn)。形成這一現(xiàn)象的原因目前尚未見報(bào)道，有待于進(jìn)一步探索。3)從前3d的情況看，低劑量組生物接近度最大，中劑量組生物接近度次之，高劑量組生物接近度最小。因此，可以做出結(jié)論：飼喂劑量增加可以降低番茄紅素天然萃取物在大鼠體內(nèi)的生物接近度。

2.4 乳化天然番茄紅素萃取物灌胃液的生物接近度

圖5 乳化天然番茄紅素萃取物在雄性大鼠體內(nèi)的生物接近度變化Fig.5 Change in bio-accessibility of emulsified natural lycopene extract in male rats

圖5表明：經(jīng)過乳化的天然番茄紅素萃取物在受試動(dòng)物體內(nèi)的生物接近度變化與未經(jīng)乳化的天然番茄紅素萃取物在受試動(dòng)物體內(nèi)的生物接近度變化規(guī)律相似。

2.5 乳化對(duì)天然番茄紅素萃取物生物接近度的影響

選取第3天的結(jié)果進(jìn)行比較乳化與未乳化天然番茄紅素萃取物的生物接近度，結(jié)果見圖6。

圖6 連續(xù)飼喂第3天乳化與未乳化天然番茄紅素萃取物的生物接近度比較Fig.6 Bio-accessibility comparison between emulsified and unemulsified natural lycopene extracts

由圖6可知，乳化可以提高天然番茄紅素萃取物在大鼠體內(nèi)的生物接近度。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用乳化與未乳化的天然番茄紅素萃取物配制成番茄紅素含量為0.263mg/mL(低劑量)、0.525mg/mL(中劑量)和1.575mg/mL(高劑量)的灌胃液。選用250g SD雄性大鼠30只分成3組，每組10只，每天一次灌胃，收集大鼠24h內(nèi)的糞便。測(cè)定糞便中的番茄紅素含量，計(jì)算番茄紅素的生物接近度。乳化與未乳化物在大鼠體內(nèi)的生物接近度于第3天達(dá)到最大值；飼喂劑量增加可以降低乳化物與未乳化物的生物接近度；乳化可以提高番茄紅素的生物接近度。

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Effect of Emulsification on Bio-accessibility of Natural Lycopene in Male Rats

HUI Bo-di1，LI Jing2，ZHANG Yi-lin1
(1. College of Applied Arts and Sciences, Beijing Union University, Beijing 100083, China；2. College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037, China)

TS264.4

A

1002-6630(2010)13-0249-04

2008-11-24

北京市自然科學(xué)基金對(duì)外合作項(xiàng)目(SZ200511417020)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI58B06)

惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)轭惡}卜素生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn