高效液相色譜-基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜分離鑒定牛乳鐵蛋白素

安美忱, 劉 寧

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150030)

高效液相色譜-基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜分離鑒定牛乳鐵蛋白素

安美忱, 劉 寧＊

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150030)

建立了高效液相色譜-基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜(MALD I-TO F/TO F MS)分離鑒定牛乳鐵蛋白素(bovine lactoferricin,Lfcin B)的方法。采用胃蛋白酶酶解牛乳鐵蛋白,酶解液離心后取上清液,經過離子交換色譜、反相液相色譜、透析等技術分離,對分離得到的目標產物進行抗菌活性分析、蛋白含量測定和MALD ITOF/TO F MS鑒定。分離得到高活性的LfcinB,其相對分子質量為3 124.89,蛋白含量為18.20μg/mL。本方法具有精度高、分析速度快和分辨能力強等優點,是其他傳統的分析鑒定LfcinB方法所無法比擬的,為進一步研究LfcinB奠定了基礎。

高效液相色譜;基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜;牛乳鐵蛋白素;牛乳鐵蛋白

Abstract:A high performance liquid Chromatography-matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/time of flight mass spectrometry(HPLC-MALD I-TO F/TO F MS)method was developed for the separation and identification of bovine lactoferricin(LfcinB).Bovine lactoferrin was hydrolyzed by pepsin and then separated by ion exchange Chromatography and reversed-phase liquid Chromatography(RP-LC).The antibacterial activities of the fractions from RP-LC separation were determined and the protein concentration of the fraction with the highest activity was measured,whose sequence was indentified by MALD I-TO F/TO F MS.The relative molecular mass of LfcinB was3 124.89and the protein concentration was18.20μg/mL.The method of producing LfcinB proposed in this study has fast speed,high accuracy and high resolution.

Key words:high performance liquid Chromatography(HPLC);matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/time of flight massspectrometry(MALD I-TO F/TO F MS);bovine lactoferricin;bovine lactoferrin

牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin)是富含在牛初乳中的一種功能因子,是轉鐵蛋白家族中一種天然的鐵離子結合糖蛋白,參與鐵的轉運,并具有抗菌、抗病毒、抗癌、調節免疫系統、抗氧化和促進骨骼生長等功能[1,2]。牛乳鐵蛋白雖然具有一定的抗菌活性,但酶解后可獲得活性更高的抗菌肽段。已有若干種抗菌肽段從牛乳鐵蛋白的酶解液中獲得,其中牛乳鐵蛋白素(bovine lactoferricin,LfcinB)因抗菌活性最強而成為研究熱點[3,4]。LfcinB來源于牛乳鐵蛋白的第17～41位氨基酸,由25個氨基酸殘基組成,氨基酸順序為Phe(F)-Lys(K)-Cys(C)-A rg(R)-A rg(R)-Trp(W)-G ln(Q)-Trp(W)-A rg(R)-M et(M)-Lys(K)-Lys(K)-Leu(L)-G ly(G)-A la(A)-Pro(P)-Ser(S)-Ile(I)-Thr(T)-Cys(C)-Val(V)-A rg(R)-A rg(R)-A la(A)-Phe(F),包括5個A rg、2個Trp和多個芳香族氨基酸殘基,具有強堿性,其p I>8.5,相對分子質量(Mr)為3 124,其中的2個Cys通過形成分子內二硫鍵使LfcinB分子呈環狀結構[5,6]。L……