中國(guó)沿海10種方蟹16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究

徐敬明

(重慶文理學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 重慶 永川 402168)

中國(guó)沿海10種方蟹16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究

徐敬明

(重慶文理學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 重慶 永川 402168)

中國(guó)沿海10種方蟹線(xiàn)粒體16S rRNA基因部分片段的序列長(zhǎng)度為517 bp～533 bp。它們的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似, A+T的含量(69.8%～76.0%)明顯高于G+C的含量; 10種方蟹的16S rRNA基因序列比對(duì)獲得541 bp的同源序列(含插入/缺失位點(diǎn)), 除插入/缺失位點(diǎn)外共檢測(cè)到146個(gè)變異位點(diǎn), 其中81個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。4種厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離(0.054～0.085)都顯著小于與其他方蟹之間的遺傳距離, 甚至明顯小于與4種厚蟹原本屬于同一相手蟹科的2種相手蟹之間的遺傳距離(0.105～0.155); 而基于16S rRNA基因片段序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也顯示, 原本屬于相手蟹科的側(cè)足厚蟹、天津厚蟹、日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹沒(méi)有與 2種相手蟹聚為一支, 而是最終與屬于弓蟹科的2種近方蟹聚為一大支, 且有高達(dá)99%的支持率。結(jié)果表明, 4種厚蟹與2種近方蟹的親緣關(guān)系相對(duì)較近, 而與2種相手蟹等其他方蟹的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。因此, 研究結(jié)果支持將4種厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。此外, 屬于相手蟹科的 2種相手蟹聚為一支, 屬于方蟹科的白紋方蟹和屬于斜紋蟹科的瘤突斜紋蟹又各自成為一支; 表明 16S rRNA基因的分子數(shù)據(jù)支持其形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果的正確性, 提示上述4科蟹類(lèi)可能分別為單系。

方蟹; 16S rRNA; 序列; 系統(tǒng)發(fā)生

方蟹是我國(guó)沿海常見(jiàn)的具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蟹類(lèi), 隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae), 該科又分為方蟹亞科(Grapsinae)、弓蟹亞科(Varuninae)、相手蟹亞科(Sesarminae)和斜紋蟹亞科(Plagusiinae)[1]。近來(lái), 一些學(xué)者根據(jù)幼體形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的研究而將方蟹科提升為方蟹總科(Grapsoidea), 其中包括原方蟹科中的 4個(gè)亞科被提升為科的方蟹科(Grapsidae)、相手蟹科(Sesarmidae)、弓蟹科(Varunidae)和斜紋蟹科(Plagusiidae)以及地蟹科(Gecarcinidae)和 2001年新建立的雕刻方蟹科(Glyptograpsidae); 并將厚蟹屬(Helice)等蟹類(lèi)從相手蟹科移到弓蟹科[2～6]。

動(dòng)物線(xiàn)粒體 DNA(mtDNA)因其分子量小、母系遺傳、比核DNA進(jìn)化速率快等特征而廣泛地應(yīng)用于進(jìn)化生物學(xué)研究中; 而mtDNA 16S rRNA基因有較高的保守性, 易于進(jìn)行 PCR引物的設(shè)計(jì)和擴(kuò)增, 非常適合于種及其以上分類(lèi)階元的差異研究[7,8]。16S rRNA基因序列已被廣泛用于蟹類(lèi)的分子系統(tǒng)學(xué)研究[9～14], 已有一些學(xué)者基于16S rRNA基因序列分別對(duì)美國(guó)、日本等地的部分方蟹進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析[2～4,15]。

本研究采用線(xiàn)粒體 16S rRNA基因作為分子標(biāo)記, 對(duì)產(chǎn)于中國(guó)沿海的10種方蟹進(jìn)行了序列測(cè)定和分子系統(tǒng)關(guān)系分析, 探討它們之間的遺傳差異及親緣關(guān)系, 以期為蟹類(lèi)的種質(zhì)鑒定、物種保護(hù)和資源評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料, 為進(jìn)一步研究蟹類(lèi)分子系統(tǒng)學(xué)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本(包括紅螯相手蟹和褶痕相手蟹[16])的采集地點(diǎn)、數(shù)量及時(shí)間等信息見(jiàn)表1。標(biāo)本浸泡于95%乙醇或保存于-40℃冰箱中備用。

1.2 DNA提取

從蟹類(lèi)的步足和螯足中取約 50 mg肌肉, 采用傳統(tǒng)法(酚/氯仿抽提法)從肌肉組織中提取基因組DNA。將乙醇沉淀后DNA溶解入40 μL超純水, 放入4 ℃冰箱6 h, 最后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 測(cè)序用蟹類(lèi)取樣信息Tab. 1 Crabs used in sequence analysis of mitochondrial 16S rRNA gene

1.3 PCR擴(kuò)增

以 L2510 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′和 H3059 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′為引物對(duì)16S rRNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體積為 25 μL, 反應(yīng)液中含 2.5 μL 10× PCR buffer, 2.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 2.0 μL MgCl2(25 mmol/L), 1 μL 模板 DNA, 引物各 0.5 μL(10 μmol/L),0.2 μLTaq酶(5 U/μL), 無(wú)菌去離子水補(bǔ)足到 25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為： 94℃預(yù)變性1.5 min后, 94 ℃變性30 s, 49 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 循環(huán)39次, 然后在72℃延伸5 min, 于4 ℃保存。

1.4 序列測(cè)定

PCR產(chǎn)物用含有溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察、照相。對(duì)于擴(kuò)增效果良好的樣品進(jìn)行回收, 回收時(shí)用 1.0%瓊脂糖凝膠, Ta-KaRa Agarose Gel DNA Purification Kit(寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行回收和純化, 純化產(chǎn)物送至上海英駿測(cè)序公司, 用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行正反鏈雙向測(cè)序。測(cè)序所用引物和PCR擴(kuò)增時(shí)的引物相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先仔細(xì)核對(duì)測(cè)序膠圖, 所有序列均由DNASTAR軟件包(DNASTAR, Inc., Madison, USA)進(jìn)行編輯、校對(duì)和比對(duì), 并對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行分析; 所有序列為兩端去引物后的序列。用DNASP軟件檢測(cè)變異位點(diǎn)數(shù)(Variable sites)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)(Parsimony informative sites)。用 MEGA(Version4.0)軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成, 計(jì)算種間的遺傳距離,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和分子進(jìn)化分析。所有序列之間基于Kimura-雙參數(shù)距離模型估計(jì)其遺傳距離; 用 NJ法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),系統(tǒng)樹(shù)各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值(Bootstrap value)表示, 各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50%的支持率。

2 結(jié)果

對(duì)表1中除紅螯相手蟹和褶痕相手蟹[16]之外的9種蟹類(lèi)的線(xiàn)粒體16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定。每種蟹類(lèi)的 3個(gè)不同個(gè)體之間序列沒(méi)有差異。它們的序列長(zhǎng)度、堿基組成和GenBank登錄號(hào)分別見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn), 10種方蟹的A、T、G、C含量只有略微的差異, 表現(xiàn)為與其他蟹類(lèi)相同的特點(diǎn)[2,14], 即 A+T含量(69.8%～76.0%)明顯高于G+C含量。

10種方蟹的16S rRNA基因序列比對(duì)獲得541 bp的同源序列(含插入/缺失位點(diǎn)), 除插入/缺失位點(diǎn)外共檢測(cè)到146個(gè)變異位點(diǎn), 其中81個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

利用Kimura-雙參數(shù)法計(jì)算得到了10種方蟹種間的遺傳距離(表3)。遺傳距離顯示, 2種厚蟹和2種仿厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離為0.054～0.085, 都顯著的小于與其他方蟹之間的遺傳距離。

以寬身大眼蟹(DLA)為外群, 基于16S rRNA基因片段序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示(圖 1)： 側(cè)足厚蟹和天津厚蟹, 日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹首先各自聚到一起成為兩個(gè)分支, 然后二者聚到一起成為一支, 再與弓蟹科的肉球近方蟹和絨螯近方蟹聚為一支, 支持率高達(dá) 99%; 但厚蟹在形態(tài)分類(lèi)上原本屬于相手蟹科。此外, 2種相手蟹聚為一支, 屬于相手蟹科; 白紋方蟹和瘤突斜紋蟹各自成為一支, 分別屬于方蟹科和斜紋蟹科。

表3 10種方蟹之間的遺傳距離Tab. 3 Interspecific genetic distances among ten Grapsoidea species

3 討論

Schubart等[3]研究了Helice crassamtDNA的16S rRNA部分序列, 結(jié)果顯示其與弓蟹科蟹類(lèi)的親緣關(guān)系最近, 建議將其從相手蟹科移到弓蟹科; Kitaura等[4]研究了三齒厚蟹(H. tridens)mtDNA的16S rRNA全序列, 孫紅英等[5]研究了天津厚蟹(Helice tientsinensis)mtDNA的 16S rRNA部分序列, 以及Schubart 等[15]研究了短螯厚蟹(H. leachii)mtDNA的12S rRNA和16S rRNA部分序列, 研究結(jié)果分別支持將天津厚蟹、三齒厚蟹和短螯厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。

圖1 10種方蟹及外群16S rRNA基因序列NJ系統(tǒng)樹(shù)Fig. 1 Neighbor-Joining tree for 16S rRNA gene of ten Grapsoidea species and outgroup

上述研究均僅通過(guò)對(duì)某一種厚蟹的研究來(lái)探討厚蟹的分類(lèi)地位。而本研究的所有4種厚蟹與2種近方蟹的遺傳距離(0.054～0.085)都顯著的小于與其他方蟹之間的遺傳距離, 特別是 4種厚蟹與原本屬于同一相手蟹科的 2種相手蟹之間的遺傳距離達(dá)到了0.105～0.155(表3); 而基于16S rRNA基因片段序列采用 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖 1)也顯示, 原本屬于相手蟹科的側(cè)足厚蟹、天津厚蟹、日本仿厚蟹和伍氏仿厚蟹沒(méi)有與2種相手蟹聚為一支,而是最終與屬于弓蟹科的 2種近方蟹聚為一大支,且有高達(dá) 99%的支持率。此結(jié)果表明 4種厚蟹與 2種近方蟹的親緣關(guān)系相對(duì)較近, 而與 2種相手蟹等其他方蟹的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。因此, 本研究結(jié)果支持將 4種厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科, 從而進(jìn)一步明確了厚蟹的分類(lèi)地位。從形態(tài)上來(lái)看, 厚蟹等蟹類(lèi)的雄性生殖孔的位置與弓蟹科蟹類(lèi)胸孔的位置相一致; 而厚蟹等蟹類(lèi)從 狀幼體到大眼幼體的形態(tài)特征亦與弓蟹科蟹類(lèi)相一致[3]。因此, 形態(tài)學(xué)的有關(guān)特征亦支持將厚蟹從相手蟹科移到弓蟹科。

此外, 屬于相手蟹科的2種相手蟹聚為一支, 屬于方蟹科的白紋方蟹和屬于斜紋蟹科的瘤突斜紋蟹又各自成為一支; 表明16S rRNA基因的分子數(shù)據(jù)支持其形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果的正確性[6], 提示上述4科蟹類(lèi)可能分別為單系, 但這還有待于對(duì)這些科的更多蟹類(lèi)進(jìn)行相關(guān)研究后才能確定。

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Molecular phylogeny of grapsoid crabs (Crustacea, Decapoda)based on partial sequences of mitochondrial 16S rRNA gene from China

XU Jing-ming
(College of Life Science and Technology, Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402168,China)

Jan., 22, 2010

Grapsoid crabs; 16S rRNA; Sequence; Phylogeny

Partial sequences of mitochondrial 16S rRNA gene of ten species crabs of Grapsoidea from the coast of China were determined and subjected to phylogenetic analysis. The lengths of sequences were from 517 to 533bp.The A, T, G and C contents of them were similar, and AT contents(69.8%～76.0%)were higher than GC contents.Furthermore, the 541bp homologous segments were analyzed. The results showed that there were 146 variable sites and 81 parsimony-information sites in the nucleotides. The genetic distances between four species, Helice latimera,H. tientsinensis, Helicana japonica and H. wuana, and two species, Hemigrapsus sanguineus and H. penicillatus,were from 0.054 to 0.085, which were much smaller than that (0.105～0.155) between the four species of Helice and Helicana and two species of Chiromantes haematocheir and Parasesarma plicatum. However, the four species of Helice and Helicana and the two species of C. haematocheir and P. plicatum had been believed to belong to family Sesarmidae. Topological structure of the molecular phylogenetic tree constructed by 541bp homologous segments with Neighbor-Joining method showed that the four species of Helice and Helicana eventually were clustered into a distinct clade (99% confidence level) with the two species of H. sanguineus and H. penicillatus. But, the two species of Hemigrapsus belonged to family Varunidae. Therefore, the results supported that the four species of Helice and Helicana were transferred from Sesarmidae to Varunidae. In addition, the two species of C. haematocheir and P. plicatum that belong to family Sesarmidae were clustered into a distinct clade, and two other distinct clades were formed by Grapsus albolineatus and Plagusia squamosa that belong to families Grapsidae and Plagusiidae respectively. The results revealed that Grapsidae, Sesarmidae, Varunidae and Plagusiidae should be monophyletic, respectively.

Q178.53;Q953

A

1000-3096(2010)10-0013-05

2010-01-22;

2010-05-19

重慶文理學(xué)院引進(jìn)人才專(zhuān)項(xiàng)(200803)

徐敬明(1963-), 男, 山東日照人, 博士, 教授, 研究方向：動(dòng)物分子與生理生態(tài), E-mail： xjingming@163.com

(本文編輯：梁德海)