野生山毛豆蛋白制備及體外消化模擬研究

于立梅，于 新，曾曉房，楊鳳卿

(仲愷農業工程學院輕工與食品學院 ，廣東 廣州 510225)

野生山毛豆蛋白制備及體外消化模擬研究

于立梅，于 新，曾曉房，楊鳳卿

(仲愷農業工程學院輕工與食品學院 ，廣東 廣州 510225)

通過堿提酸沉法制備野生山毛豆蛋白，并模擬人體消化環境，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶兩步消化法分析山毛豆蛋白的消化行為。結果表明：山毛豆中蛋白質含量約為(47.12±0.35)%，大豆中蛋白質含量約為(44.17± 0.48)%，山毛豆含有18 種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸，從非必需氨酸酸來看，山毛豆蛋白與大豆蛋白有相似的氨基酸組分，氨基酸平衡狀況較好，接近參考蛋白模式；山毛豆的體外消化率為(84.86±0.75)%，大豆的體外消化率為(91.71±0.88)%，山毛豆酶解液中的總氨基酸含量比大豆的略低，但山毛豆酶解液中甘氨酸和色氨酸含量比大豆酶解液高很多，游離氨基酸(FAA)含量比大豆的略高。

山毛豆；蛋白質；消化率

非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f)和山毛豆(Tephrosia candida)均為豆科蝶形花亞科，灰葉屬多年生灌木，原產非洲，主要分布于北緯15°至南緯20°的廣大地區。近10多年來，我國廣東、廣西、海南、云南、福建等省區大量種植山毛豆[1]。山毛豆種子是一種脂肪和蛋白含量雙高的豆類。其所含的能量充沛，100g山毛豆種子最多可提供1513.34kJ的能量。其所含的營養豐富，其中不飽和脂肪酸含量高，人體必需脂肪酸亞油酸含量占總體脂肪酸含量的52.0%，占山毛豆種子質量的6.76%，其蛋白質含量高達38.73%，可作為廉價的食用或飼用蛋白質來源，滿足生活、生產的需要[2]。

蛋白質對人體十分重要，各種食品中蛋白質含量是否豐富固然重要，但能否被人體利用或利用多少，是決定其營養價值的一個先決條件。消化率是動物從食物中所消化吸收的部分占總攝入量的百分比，是評價食物營養價值的重要指標之一。測定食物消化率主要有體外法和體內法。體內法測定的消化率能夠比較真實的反映動物對食物的消化情況。但體內法測定方法復雜、時間長、費用高，而且對外界環境的要求較高，季節、溫度、光照等都會影響消化率測定值。體外消化法是利用精制的消化酶或研究對象的消化道酶提取液在試管內進行的消化實驗，其測定值可近似反映動物對食物的消化率[3-5]。目前，國外一些報道把豆類蛋白突出的降膽固醇效果歸因于其難消化組分，特別是那些疏水性高的組分。可見，有必要了解豆類蛋白在消化道環境下的消化行為，及一些因素對該蛋白消化過程的影響。本研究通過模擬人體胃部消化環境的消化模型，分析野生山毛豆蛋白的消化情形，探討不同酶／底物比對山毛豆蛋白的消化過程的影響，測定山毛豆的蛋白質體外消化率、總氨基酸的含量和游離氨基酸(FAA)的釋放量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生山毛豆采于廣東從化上坡；大豆 吉林糧油市場。

鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉(AR級)；胃蛋白酶(1:10000) Sigma 公司；胰蛋白酶(1:250) Genview公司。

1.2 儀器與設備

CS101-1E電熱鼓風干燥箱 重慶四達實驗儀器有限公司；Agilent 1100液相色譜儀 美國安捷倫公司；中草藥粉碎機 天津市泰斯特有限公司；DHS-3C型精密pH計、KDN-08C凱氏定氮裝置 上海雷磁儀器廠；SHZ-82 水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 山毛豆蛋白(SPI)的制備

脫脂山毛豆粉用蒸餾水(1:10，m/V)分散(攪拌)完全，之后用2mol/L NaOH溶液調節至pH10以上，室溫下攪拌2h后離心(9000×g，20～30min)。離心所得的上清液經2mol/L HCl溶液調節至pH4.6，于4℃放置2h，之后離心。所得沉淀用蒸餾水洗3次，重新分散于蒸餾水，并調節至中性。該分散液經透析后冷凍干燥，即得山毛豆的分離蛋白[6-7]。

1.3.2 樣品中蛋白質含量的測定

采用微量凱氏定氮法[8-10]。

1.3.3 山毛豆蛋白質的模擬體外消化

1.3.3.1 胃蛋白酶最適量的選擇

分別稱取0.5g山毛豆分離蛋白于3個消化管中，各加入不同量胃蛋白酶(酶與底物質量比分別為1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450) 的pH1.5 的0.05mol/L HCl溶液30mL，在37℃臺式恒溫搖床上保溫3h后過濾，多次沖洗殘留物，用凱氏定氮法測定殘留物的蛋白質含量。通過計算樣品蛋白質消化率，確定出胃蛋白酶的最適用量。

1.3.3.2 胰蛋白酶最適用量的選擇

分別稱取0.5g山毛豆分離蛋白于3個消化管中，用含有1:350(酶與底物質量比)胃蛋白酶活性單位的濃度為0.05mol/L 的HCl溶液做前處理，之后加0.2mol/L 的NaOH溶液處理消化液使之pH值等于6.8。再分別加入含不同胰蛋白酶(酶與底物質量比分別為1:150、1:250、1:350、1:450) 的0.05mol/L 的KH2PO4-NaOH 緩沖液。繼續培養3h，測定樣品的蛋白質消化率，確定出胰蛋白酶的最適用量。

1.3.3.3 胃蛋白酶- 胰蛋白酶復合處理法的消化程序參照參考文獻[11-13]進行。

1.3.3.4 體外消化率的計算

式中：m1為樣品蛋白質量/g；m0為消化后濾渣蛋白質量/g。

1.3.4 氨基酸組分分析的測定(包括總氨基酸和游離氨基酸)

氨基酸組分分析：精確稱取一定量樣品于特制水解管底部，加6mol/L 鹽酸，真空封管后于(110±1)℃水解24h(色氨酸的水解條件為4mol/L 氫氧化鈉溶液，(110±1)℃水解20h)，冷卻后定容、過濾和蒸干，再加入0.02mol/L的鹽酸在空氣中放置30min，上安捷倫液相色譜儀測定18種氨基酸。游離氨基酸測定不用水解，酶解樣品直接上安捷倫液相色譜儀測定。采用鄰苯二甲醛(OPA) 柱前衍生反應。柱色譜條件：C18柱(4.0mm× 125mm)，柱溫為40℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為338nm和262nm(脯氨酸)，流動相：A：20mmol/L乙酸鈉溶液；B：20mmol/L乙酸鈉溶液-甲醇-乙腈(1:2:2，V/V)。

2 結果與分析

2.1 山毛豆和大豆中蛋白質含量的測定

表1 山毛豆與大豆蛋白質含量的對比Table 1 Protein contents of Tephrosia candida and soybean

從表1可見，山毛豆中蛋白質含量約為(47.12± 0.35)%，大豆中蛋白質含量約為(44.17±0.48)%，山毛豆所含的蛋白質要比大豆的多。

2.2 山毛豆和大豆氨基酸成分及含量分析

理想的運動蛋白應滿足必需氨基酸(EAA)和非必需氨基酸(NEAA)之間平衡良好和支鏈氨基酸含量豐富的要求。因此，食物蛋白質營養價值的高低不僅體現在必需氨基酸的種類是否齊全，而且體現在必需氨基酸之間的比例及必需氨基酸與總氨基酸(TAA)的比例是否適宜[14]。FAO/WHO推薦理想蛋白質模式為氨基酸組成EAA /TAA在40%左右，EAA/NEAA在0.60以上。山毛豆和大豆中必需氨基酸與非必需氨基酸含量見表2。

從表2可看出，山毛豆和大豆中都含有18種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸，山毛豆蛋白樣品的蛋白質18種氨基酸總量為38.08%，其中，必需氨基酸含量為13.47%，非必需氨基酸含量為24.61%。山毛豆的EAA/(EAA+NEAA)=35.37%，EAA/NEAA= 54.73%，大豆的EAA/(EAA+NEAA)=42.85%，EAA/ NEAA=74.98%，與WHO/FAO提出的EAA/(EAA +NEAA)比值和EAA/NEAA比值分別為40%左右和60%左右的參考蛋白模式相對相近，因此屬于優質蛋白。支鏈氨基酸(BCAA)包括：L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸都屬于必需氨基酸，主要在骨骼肌中進行代謝，同骨骼肌的合成有著密切的關系。在運動中，支鏈氨基酸可以促進運動后恢復期蛋白質的合成代謝， 加速肌肉合成，減少肌肉組織的分解，有助于肌肉塊的增大[15-16]。山毛豆中所含的支鏈氨基酸占到總氨基酸量的15%，大豆所含的支鏈氨基酸占總氨基酸量的13%。

表2 山毛豆和大豆中必需氨基酸與非必需氨基酸含量Table 2 Contents of EAA and NEAA in Tephrosia candida and soybean

2.3 山毛豆體外消化率分析

2.3.1 酶與底物比(E/S)對山毛豆蛋白體外消化過程的影響

任何一種酶反應的反應速率都受酶本身濃度及底物濃度的影響，酶濃度(或酶活力)越高，酶反應則越快，即達到催化終點也越快。如果底物濃度較高，則酶反應保持較高反應速率的時間也較長。本實驗通過分別測量胃蛋白酶和胰蛋白酶降解山毛豆蛋白底物所釋放出的氮含量，討論在一定山毛豆濃度下，不同酶與底物之比對山毛豆的體外胃蛋白酶消化過程的影響，從而選出胃蛋白酶和胰蛋白酶的最適用量。

2.3.1.1 胃蛋白酶最適用量的選擇

通過測量胃蛋白酶降解山毛豆底物所釋放出的氮含量，討論山毛豆質量一定(0.5g)，不同酶與底物質量之比(1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450)對山毛豆蛋白的體外胃蛋白酶消化過程的影響，結果如圖1所示，從而選出胃蛋白酶的最適用量。

圖1 不同底物胃蛋白酶質量比條件下的山毛豆蛋白質體外消化率Fig.1 Digestibility of Tephrosia candida protein digested by pepsin at varying dosages

由圖1可見，隨著底物與胃蛋白酶的比例不斷增加，山毛豆的體外消化率不斷減小，其減小的趨勢與酶用量緊密相關。在較低的E/S比值下(如1:450)，山毛豆蛋白的體外消化率僅為75.24%。然而，隨著E/S比的增大，氮的釋放量不斷增加，山毛豆蛋白的體外消化率也增大，E/S比值為1:350時，山毛豆蛋白的體外消化率為80.67%，之后趨于平緩。因此胃蛋白酶的用量應采用1:350。圖1也顯示，對于任何一種蛋白，其蛋白的體外胃蛋白酶消化率取決于所采用的胃蛋白酶酶量。當加酶量達到一定程度后，酶與底物的作用達到飽和，加大酶的用量所產生的作用較小。

2.3.1.2 胰蛋白酶最適用量的選擇

通過測定胰蛋白酶降解山毛豆底物所釋放出的氮含量，討論山毛豆質量(0.5g)，不同酶與底物質量比(1:150、1:250、1:350、1:450)對山毛豆蛋白的體外胃蛋白酶消化過程的影響，結果見圖2，從而選出胰蛋白酶的最適用量。

圖2 不同底物與胰蛋白酶質量比條件下山毛豆蛋白質體外消化率Fig.2 Digestibility of Tephrosia candida protein digested by trypsin at varying dosages

由圖2可見，隨著底物與胰蛋白酶的比例不斷增加，山毛豆蛋白的體外消化率也不斷減小，其減小的趨勢與酶用量緊密相關。隨著E/S比值的增加，氮的釋放量不斷增大，山毛豆蛋白的體外消化率也增加，E/S比值為1:350時，山毛豆蛋白的體外消化率為84.53%，之后增加趨勢緩慢。因此選胰蛋白酶的用量E/S應采用1:350。

2.3.1.3 胃蛋白酶- 胰蛋白酶復合處理法的消化分析

消化率是動物從食物中所消化吸收的部分占總攝入量的百分比，是評價食物營養價值的重要指標之一。本實驗采用胃蛋白酶、胰蛋白酶兩步體外消化法，首先用胃蛋白酶在酸性條件下完成食物在胃內的消化過程，再用胰蛋白酶在中性條件下繼續消化，完成營養成分在小腸的消化過程，最后將已消化營養成分與未消化營養成分分開，結果見表3。

表3 山毛豆與大豆蛋白體外消化率Table 3 in vitro digestibility of Tephrosia candida protein and soybean protein

表3顯示，在同等條件下進行水解，山毛豆蛋白的體外消化率 84.86%，大豆蛋白的體外消化率為 91.71%。山毛豆作為野生資源，來源廣泛，市場價格低于大豆很多，消化率稍低于大豆，可以作為大豆的替代品，所以在食品和動物飼料中具有潛在應用價值。

2.3.2 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的總氨基酸和游離氨基酸含量的測定

表4 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的總氨基酸含量Table 4 Total amino acid contents in the separate hydrolysates of Tephrosia candida and soybean

蛋白質是構成人體細胞的主要成分，食物中的蛋白質進入人體后經過消化先分解成氨基酸，氨基酸是構建生物機體的眾多生物活性大分子之一，是構建細胞、修復組織的基礎材料。氨基酸能夠為機體和大腦活動提供能源，氨基酸是一切生命之源。山毛豆和大豆酶解液中的總氨基酸和游離氨基酸(FAA)含量的分析結果見表4、5。

表5 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的游離氨基酸(FAA)含量Table 5 Free amino acid contents in the separate hydrolysates of Tephrosia candida and soybean

由表4、5可知，山毛豆蛋白酶解液中的總氨基酸含量比大豆的略低，但山毛豆蛋白酶解液總氨基酸中的甘氨酸和色氨酸含量比大豆酶解液高很多，近來的研究表明，甘氨酸可通過作用于細胞膜上的甘氨酸受體(GlyR)防止枯否細胞過度激活，從而對多種原因引起的肝損害起明顯的保護作用。色氨酸是一種必需氨基酸，可以防止煙酸缺乏癥和增加血清素水平。在所有氨基酸中，色氨酸被認為是特定食品中含量最少的。雖然稀少，色氨酸是非常必要的，因為它會由肝臟轉換成VB3(煙酸和煙酰胺)，這有助于防止煙酸缺乏癥[17]。山毛豆蛋白酶解液游離氨基酸(FAA)含量比大豆的略高，由此也證明了山毛豆蛋白的體外消化率比大豆略低。因此山毛豆蛋白具有較大的潛在應用營養價值。

3 結 論

本研究通過模擬人體胃部消化環境的消化模型，分析了山毛豆蛋白的消化情形，對比了山毛豆和大豆蛋白質的體外消化率，測定了總氨基酸的含量和游離氨基酸(FAA)的釋放量。結論如下：山毛豆中蛋白質含量約為(47.12±0.35)%，大豆中蛋白質含量約為(44.17±0.48)%，山毛豆所含的蛋白質要比大豆的多。山毛豆蛋白質模擬體外消化分析：在一定蛋白濃度下，隨E/S之比的增加，氮的釋放量不斷增加，山毛豆蛋白的體外消化率也增加。胃蛋白酶最適量的選擇為1:350，胰蛋白酶最適用量的選擇為1:350。山毛豆蛋白質體外消化率(84.86± 0.75)%，大豆蛋白質體外消化率為(91.71±0.88)%，大豆蛋白的體外消化率比山毛豆高。山毛豆蛋白酶解液中的總氨基酸含量比大豆的略低，游離氨基酸(FAA)含量比大豆的略高。綜上所述，山毛豆的蛋白質含量較高，但體外消化率不如大豆，但從成本來說，山毛豆價格遠遠低于大豆，所以山毛豆蛋白在食品和動物飼料中具有潛在應用價值。

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Preparation andin vitroDigestibility ofTephrosia candidaProtein

YU Li-mei，YU Xin，ZENG Xiao-fang，YANG Feng-qing
(College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Tephrosia candidaprotein (TCP) was obtained through alkaline extraction and acid precipitation. Its digestion behavior was explored through two-step digestion using pepsin and trypsin in mimic digestion environment. Results exhibited that the content of soybean protein was (44.17 ± 0.48)%, the content of TCP was (47.12 ± 0.35)% and this protein was composed of 18 kinds of free amino acids including 8 kinds of essential acids. However, similar amino acid pattern between TCP and soybean protein was observed. The digestibility of TCP was (84.86 ± 0.75)%, while the digestibility of soybean protein was (91.71 ± 0.88)%. The content of total amino acids of TCP hydrolysates was lower than that of soybean hydrolysates, but the contents of some of the tested free amino acids were higher than those of their counterparts in TCP hydrolysates.

Tephrosia candida；protein；digestibility

TS214.9

A

1002-6630(2010)13-0060-05

2009-12-03

廣東省科技計劃資助項目(2008B030302001)

于立梅(1973—)，女，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：biyingwang2003@163.com