納米均相時間分辨熒光免疫法檢測脫氧雪腐鐮刀菌醇方法的建立

周 彬，高 雷，金 堅，陳 蘊，黃 飚，*，趙衛國

(1.江蘇省原子醫學研究所衛生部核醫學重點實驗室，江蘇無錫214063; 2.江南大學醫藥學院，江蘇無錫214063;3.博陽生物科技(上海)有限公司，上海200000)

納米均相時間分辨熒光免疫法檢測脫氧雪腐鐮刀菌醇方法的建立

周 彬1，高 雷2，金 堅2，陳 蘊2，黃 飚1，*，趙衛國3

(1.江蘇省原子醫學研究所衛生部核醫學重點實驗室，江蘇無錫214063; 2.江南大學醫藥學院，江蘇無錫214063;3.博陽生物科技(上海)有限公司，上海200000)

目的:利用抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)多克隆抗體，采用納米均相時間分辨熒光免疫法測定技術(AlphaLISA)建立間接競爭DON定量檢測方法。方法:DON－BSA包被發光微粒，生物素化羊抗兔抗體與包被有鏈霉素的感光微粒共同構成檢測試劑，優化檢測條件并評價檢測性能。結果:該方法的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL，批內批間變異系數均＜5%。不同樣品添加回收實驗:玉米、小麥、啤酒回收率分別為84%～110%、67%～100%、74%～100%。結論:DON－AlphaLISA是目前DON檢測中最靈敏的方法之一，該分析方法穩定性好，可測范圍寬，具有很好的應用前景。

脫氧雪腐鐮刀烯醇，生物毒素，納米均相時間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DON人工抗原、抗DON多克隆抗體和DON標準品及DON酶免試劑盒 江蘇省微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;親和層析純化的生物素化羊抗兔IgG 洛陽華美生物工程公司;光激化學感光液、發光微粒、白色不透明微孔板、AlphaLISA檢測儀 上海博陽生物科技有限公司;檢測樣品購于本地超市;其它試劑 均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 DON標準品的配制 用樣品稀釋液(10mmol/L，pH7.4的PBS)稀釋DON標準品，配制成0，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的系列標準品。

1.2.2 間接競爭DON－AlphaLISA方法的建立

1.2.2.1 DON人工抗原包被發光微粒的制備 在離心管中加入1mg感光微粒，12.5μL 1%Tween－20，0.05mg DON－BSA抗原，10μL硼氫化氰鈉，用0.1mol pH6.0的2－(N－嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補充至200μL，37℃避光反應48h。然后加入10μL 0.3mol pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結合位點，37℃避光孵育1h后離心，分離得到已連接DON－BSA的感光微粒，稀釋后備用。

1.2.2.2 樣品處理 稱取谷物樣品或其制品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min后，用微孔濾膜(直徑為0.45μm)過濾，取1mL濾液用1mL蒸餾水稀釋備用。啤酒樣品用蒸餾水比例稀釋后進行檢測。谷物及其制品中DON含量(ng/g)=提取液中DON含量×10。啤酒樣品中DON含量為測得值乘以相應的稀釋倍數。

1.2.2.3 檢測步驟 取白色微孔板若干，加入20μL/孔包被有DON－BSA的發光微粒，加入20μL/孔DON標準品或待測樣品，然后加入20μL/孔的DON多克隆抗體，最后加入生物素化的羊抗兔抗體。充分混勻上述各種試劑，37℃溫育，加入包被有鏈霉親合素的感光微粒(100μg/mL)175μL，37℃溫育。在AlphaLISA檢測儀中檢測每孔發光光子量，根據光信號的強度繪制標準曲線，由標準曲線計算待測樣品DON的濃度，見圖1。

圖1 均相間接競爭DON－AlphaLISA檢測原理

1.2.2.4 反應條件的優化 建立間接競爭 DONAlphaLISA方法，對DON人工抗原－發光微粒，DON多抗稀釋度，生物素化－羊抗兔抗體稀釋度予以選擇，以達到最適的測定條件和節省測定費用。

a.DON抗原－發光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇 取白色微孔板，用反應緩沖液將DON抗原－發光微粒作一系列稀釋:1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，每種濃度1條，最后2孔只加反應緩沖液以作空白對照。DON多克隆分別以1∶100，1∶500，1∶1000，1∶5000，1∶10000稀釋，每個濃度2孔/條。按1.2.2.3步驟測定各稀釋度的熒光計數，統計檢測結果。

b.生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定 按照已經確定的DON抗原－發光微粒與DON多克隆抗體工作濃度，取白色微孔板，第一條加入20μL DON抗原－發光微粒，20μL標準品稀釋液(零濃度點)和20μL抗DON多克隆抗體，第二條加入20μL DON抗原－發光微粒，20μL標準品稀釋液和20μL抗體稀釋液(非特異結合，Nonspecific binding，NSB)。將生物素化羊抗兔 IgG用稀釋液作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800等比例稀釋后分別加入上述板條中，20μL/孔，每個稀釋度兩孔。按1.2.2.3步驟測定各稀釋度的熒光計數，以熒光計數為縱坐標，生物素化羊抗兔IgG稀釋度為橫坐標，繪制曲線。選擇零點熒光計數高，NSB低的生物素化羊抗兔IgG稀釋度作為工作濃度。

c.反應動力學考察 最適競爭反應溫度、時間的確定:按已確定的試劑工作濃度分別加入到白色微孔板中，25℃或37℃條件下，分別溫育10、15、30、45min，給予感光微粒充足的反應時間。其他步驟同1.2.2.3，測定不同溫度以及競爭時間下的標準曲線變化趨勢。連有鏈霉親合素的感光微粒反應溫度、時間的確定:按1.2.2.3操作，感光微粒反應以不同的溫度:25、37℃溫育，不同的時間:10、15、30、45min，測定零濃度點的熒光計數。

d.標準曲線的繪制 由AlphaLISA分析儀直接得到的是各劑量點對應的計數值(CPS)，通過origin軟件對數據進行分析處理。

1.3 方法學考核

1.3.1 回收率 稱取玉米、小麥樣品或加有DON標準品的玉米、小麥樣品2g，加入10mL蒸餾水，充分振蕩5min，微孔濾膜(直徑=0.45μm)過濾，取1mL濾液用PBS稀釋備用。通過計算實測值與理論值比值得出回收率。添加不同量的DON標準品的啤酒樣品，經比例稀釋后直接檢測。

1.3.2 方法學的比較 取啤酒樣品若干份，采用DON－AlphaLISA和DON－ELISA進行對照實驗。分別用DON－AlphaLISA、DON－ELISA兩種不同的免疫檢測法對16份啤酒和22份玉米樣品進行分析，比較不同檢測方法的檢測結果關聯性。

2 結果與討論

2.1 DON抗原－發光微粒與DON多克隆抗體工作濃度的選擇

標記DON－BSA以及標記成功后復合物反應濃度對建立標準曲線的靈敏度有著至關重要的影響作用。因此選擇合適的稀釋比例是整個實驗成敗的關鍵。在實驗中深入探討了連有發光微粒的DONBSA以及抗DON PcAb最佳工作濃度，結果見表1。

由表1可知，當連有發光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶10時，雖然可以得到較高的計數(接近或大于10000)，但是由于高濃度的發光微粒導致本底比較高(本底為256);當連有發光微粒的DON－BSA稀釋比為1∶1000時，可以有效的降低本底(本底僅為38)，但數零點計數下降明顯(最高計數為3493)。因此，選擇經過適當比例稀釋的DON抗原－發光微粒意義非同尋常，必須滿足保證有效的計數，同時又可以節約成本和降低本底。根據上述要求，稀釋比在1∶100左右較為適合。

選取適當的多抗濃度可以提高檢測靈敏度。對照實驗結果得出:多抗稀釋比在1∶1000～1∶5000范圍內比較適合，既滿足了檢測要求也節約了試劑用量。

表1 DON－BSA－發光微粒和抗DON PcAb工作濃度的選擇(熒光計數(CPS))

2.2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的確定

選擇合適的生物素化羊抗兔IgG稀釋度，既能保證有足夠的量結合到第一抗體上，又要避免引起非特異計數(NSB)的增加。在間接競爭 DONAlphaLISA，進行第二步反應時，抗體稀釋液將生物素化羊抗兔IgG稀釋成不同的濃度，結果如圖2。

圖2 生物素化羊抗兔IgG稀釋度的選擇

由圖2可知，當生物素化羊抗兔IgG的稀釋比不斷加大時，零濃度點的熒光計數以及NSB均在1∶100稀釋后開始下降明顯，而在1∶200稀釋后，下降趨于平緩。生物素化羊抗兔IgG 1∶100稀釋時，其零濃度點的熒光計數為1∶50的61.2%，NSB為1∶50的21.78%。所以，選擇1∶100的生物素化羊抗兔IgG作為最佳稀釋濃度。

2.3 不同溫度下的競爭反應時間的確定

反應溫度分別設在25、37℃，進行時間動力學的考核。25℃，給予充足的示蹤反應時間(生物素與親和素結合反應)，測定不同競爭時間下標準曲線，結果見圖3。

圖3 25℃，競爭反應時間對DON－AlphaLISA的影響

由圖3可知隨著反應時間的延長，各濃度點的熒光計數逐漸增大，但增幅各不相同，ED50所對應的濃度點隨時間延長而減小，曲線靈敏度趨高。競爭反應時間30min與45min下的標準曲線，已無明顯差異。因此，選擇30min為最適競爭反應時間。

按照同樣的方法，將反應溫度設為37℃，繪制不同競爭時間下標準曲線。結果見圖4。按照上述分析原理，此時15min的競爭反應時間已經得到靈敏度較高的標準曲線。因此，37℃反應溫度下，15min為最適競爭反應時間。從節約時間成本的角度考慮，選擇37℃，15min為DON－AlphaLISA競爭反應條件。

圖4 37℃，競爭反應時間對DON－AlphaLISA的影響

2.4 連有鏈霉親合素的感光微粒反應溫度、時間的確定

生物素與親和素可以在較短的時間內完成結合反應。在25℃條件下，不同示蹤時間下的標準曲線的結果見圖5。結果表明15～30min的反應時間基本能夠完成生物素與親和素結合反應。

圖5 25℃，示蹤時間對DON－AlphaLISA的影響

在37℃條件下，不同示蹤時間下的標準曲線的結果見圖6。反應時間為10min時生物素與親和素的反應完成一半或許更多。當反應時間延長至15min已經基本完成反應。進一步延長反應時間對提高檢測的靈敏度并無顯著影響。因此，選擇37℃，15min作為示蹤反應時間即可。

2.5 DON－AlphaLISA標準曲線的繪制

綜合各項優化的結果，間接競爭 DONAlphaLISA的最適檢測條件為:DON人工抗原－發光微粒稀釋度1∶100;抗DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時間分別是37℃ 15min和37℃ 15min。間接競爭DON－AlphaLISA的結果經orgin軟件處理所得的標準曲線，見圖7。

圖6 37℃，示蹤時間對DON－AlphaLISA的影響

圖7 均相間接競爭DON－AlphaLISA標準曲線

以10組標準曲線零濃度點計數的平均值(ˉX)和標準差(SD)，以ˉX的計數減2倍SD所得的計數從標準曲線中找到對應濃度及方法的檢測靈敏度。間接競爭DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL，IC50為4.84ng/mL。

2.6 添加回收率實驗

已知濃度的DON添加到各樣品中，采用均相間接競爭DON－AlphaLISA方法檢測，各個濃度的檢測結果見表2。從表2可以看到，平行孔間的CV相對較小，這可能是由于均相檢測的原因，減少人為操作誤差導致的批內變異。這一結果充分說明了檢測穩定性較好。整個樣品添加回收率偏低，這可能是樣品處理過程中損失造成的。除了個別樣品，大部分也還在可接受范圍內(＜±20%)。

表2 添加回收率測定結果

2.7 方法學比較

2.7.1 DON－AlphaLISA和DON－ELISA檢測啤酒和玉米樣品的比較 用本實驗室建立的DONAlphaLISA和DON－ELISA同時檢測16份啤酒樣品，對兩種方法的檢測結果進行線性回歸分析，結果如圖8所示。其 Y=1.05910X－0.5185，相關系數為0.9525，表明兩種檢測方法的相關性很好。由結果觀察測得值在較低濃度范圍內(＜10ng/mL)，DONAlphaLISA測得值略微高于DON－ELISA，而在高濃度范圍內又呈現出相反的關系。導致這樣的結果，可能是啤酒中存在某些干擾基質。

圖8 不同免疫檢測法檢測啤酒樣品的結果比較

采用本實驗室建立的DON－AlphaLISA試劑盒和DON－ELISA試劑盒檢測22份玉米樣品，對兩種方法的檢測結果進行對照比較。結果如圖9所示。其Y=0.0508+1.1591X，R=0.9167，其中兩份樣品由于DON含量低于DON－ELISA檢測限，而DONAlphaLISA的檢測值分別為0.075ng/mL和0.037ng/mL。表明兩種檢測方法的相關性很好且DON－AlphaLISA檢測方法更靈敏。

圖9 不同免疫檢測法檢測玉米樣品的結果比較

3 結論

納米均相時間分辨熒光(AlphaLISA)是由光激發產生的均相化學發光技術。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點。AlphaLISA技術的核心原理是高能態離子氧的產生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環境中的氧轉化為高能態離子氧，如果發光微粒在200nm范圍之內就能接受離子氧，并發出高能級的光(520～620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內沒有發光微粒，高能態離子氧就會回落到基態氧而沒有信號產生［6－7］。

DON－AlphaLISA的測定基礎是標記免疫反應。包被有發光微粒的DON－BSA加入微孔板，然后順序加入DON標準或樣品、抗DON PcAb、生物素化羊抗兔抗體避光反應，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測。包被有發光微粒的DON－BSA與DON競爭連接到DON抗體，然后與生物素化羊抗兔IgG以及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復合體，在特定條件下發光微粒將信號通過連接在一起的復合體傳遞給感光微粒產生化學發光，用化學發光檢測儀檢測光信號，光信號強度與樣品中的DON濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中DON的含量。

我們建立了均相DON－AlphaLISA免疫檢測法，均相間接競爭DON－AlphaLISA的最適檢測條件為: DON人工抗原－發光微粒稀釋度1∶100;抗 DON PcAb稀釋度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀釋度1∶100;兩步溫育的溫度與時間均為 37℃15min。DON－AlphaLISA的靈敏度為0.007ng/mL，檢測范圍為0.007～100ng/mL。

DON－AlphaLISA兩步共30min的反應模式大大縮短了檢測時間，同時由于免清洗減少了人為誤差，使得檢測結果的穩定性非常好，批內、批間變異率＜5%。整個檢測過程可以自動化，方便進行大批量檢測。檢測范圍寬達到0.007～100ng/mL靈敏度和高達到0.007ng/mL。通常高的靈敏度檢測法常常易受本底干擾。但是在本實驗中并沒有顯現出明顯的基質干擾現象(本底＜20計數)。DON－AlphaLISA另一大優勢是節約試劑劑量，檢測樣本量較少僅為20μL/孔。添加回收率實驗結果表明回收率均值在90%左右，同時CV值較小說明檢測的穩定性較好。

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［3］李群偉，侯海峰，李亞魯，等.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇致家兔多臟器損傷的實驗觀察［J］.中國地方病防治雜志，2007，22 (1):19－22.

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Quantitative determination of deoxynivalenol using light initiated chemiluminescence assay

ZHOU Bin1，GAO Lei2，JIN Jian2，CHEN Yun2，HUANG Biao1，*，ZHAO Wei－guo3
(1.Key Laboratory of Nuclear Medicine，Ministry of Health PRC，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine of Jiangsu province，Wuxi 214063，China;2.School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214063，China; 3.Shanghai Boyang Biotechnology Company Ltd.，Shanghai 200000，China)

Objective:An indirect competitive light initiated homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA)was established by using anti－DON polyclonal antibody and coating antigen DON－BSA for detection of deoxyhivalenol in cereal.Method:DON－BSA was coated on chenilum inescent particles，the AlphaLISA kit also contained sensitizer particles coated with strep tavidin.The optinal test conditions and analytical performance of the method were studied.Results:Working concentration range from 0.007 to 100ng/mL and the sensitivity for detection was 0.007ng/mL.The intra－and inter－assay CV of the assay were both below 5%.The recoveries of determination for deoxynivalenol spiked in corn，wheat，beer were 84%～110%、67%～100%、74%～100%.Conclusions:This AlphaLISA method is a good method with high sensitivity for quantitative analyzing DON in cereal.

deoxynivalenol;biotoxin;homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay(AlphaLISA)

Q939.91

A

1002－0306(2010)08－0338－05

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯族毒素，主要由禾谷鐮刀菌產生。目前，世界范圍內DON對谷物的污染居各種生物毒素之首，呈較嚴重的狀況，而長期暴露于高濃度的DON毒素可導致營養不良，表現不同水平的中毒癥狀，甚至死亡［1］。因此監控DON的含量顯得意義重大。我國目前小麥、玉米中DON的限量為1000μg/kg［2］，而部分國家(如奧地利和歐盟等)的限量標準低于我國的限量標準。檢測DON的方法有理化檢測法和免疫化學法。前者主要包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)［3］。后者研究較多的是酶聯免疫分析法(ELISA)［4－5］。ELISA檢測法存在標記物酶易失活、底物見光易分解、環境干擾因素復雜等缺點，且已不能滿足越來越低的限量標準。因此，本研究采用快速高靈敏的納米均相時間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)檢測谷物及其制品中的DON含量。

2009－08－20 *通訊聯系人

周彬(1981－)，男，研究實習員，研究方向:食品安全檢測。

國家高技術研究發展計劃(863)(2008AA10Z415);江南大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向課題(SKLFMB－200801)。