馬尾桃樹皮中原花青素體外抗自由基作用的研究

王秋月，郁建平，蔡 立，楊文坤，沈德艷

(貴州大學(xué)生化營養(yǎng)研究所，貴州貴陽550025)

馬尾桃樹皮中原花青素體外抗自由基作用的研究

王秋月，郁建平*，蔡 立，楊文坤，沈德艷

(貴州大學(xué)生化營養(yǎng)研究所，貴州貴陽550025)

目的:對馬尾松樹皮中原花青素的體外抗自由基作用進(jìn)行了研究。方法:采用鄰二氮菲法和鄰苯三酚法研究原花青素抗羥自由基和抗超氧自由基的能力，并以抗壞血酸和SOD酶為對照進(jìn)行研究。結(jié)果:馬尾松樹皮中原花青素對羥自由基和超氧自由基都有較好的清除能力，都分別明顯高于抗壞血酸和SOD酶。結(jié)論:馬尾松樹皮中原花青素能夠清除自由基，有較好的抗氧化能力。

馬尾松，原花青素，抗自由基，羥自由基，超氧自由基

原花青素(Procyanidins，PC)是植物王國中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，具有廣泛的生物學(xué)活性，特別是其強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基作用引起世界范圍內(nèi)的關(guān)注［1－2］。松樹皮原花青素(procyanidins)［3］是一類從松樹皮中提取的天然多酚化合物，主要是由(+)－兒茶素，(－)－表兒茶素為單位聚合而成［4］，具有抗氧化和清除自由基、保護(hù)血管和神經(jīng)、抗炎及免疫調(diào)控、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等活性［5］，廣泛用于保健食品、藥物以及化妝品的生產(chǎn)［6］。我國國內(nèi)對松樹皮提取物的研究較少，馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我國特有的松屬樹種［7］，本文對馬尾松樹皮提取物原花青素體外抗自由基作用進(jìn)行了初步研究，為以后我國馬尾松樹皮提取物原花青素的系統(tǒng)研究和大力開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾松樹皮 采自貴州大學(xué)南校區(qū);FeSO4· 7H2O、鄰二氮菲 分析純，天津化學(xué)試劑公司;過氧化氫 分析純，中外合資上海遠(yuǎn)大過氧化物有限公司;蒸餾水 本實(shí)驗(yàn)室制備;抗壞血酸 分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司;鄰苯三酚 分析純，貴州遵義市第二化工廠;Tris分析純，重慶東方試劑廠;鹽酸 分析純，遵義師范學(xué)院化學(xué)試劑廠;松樹皮粗制原花青素、精制原花青素 從國產(chǎn)馬尾松樹皮中自提。

HH.S21－6型電熱恒溫水浴鍋﹑JY3002電子天平﹑雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用;101－2型干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素的制備

1.2.1.1 粗制原花青素的制備 取一定量的馬尾松樹皮粉末，按1∶30的料液比，加入70%的乙醇，在70℃水浴中浸提3h，然后將乙醇提取物減壓濃縮除去乙醇后，真空冷凍干燥。

1.2.1.2 精制原花青素的制備 取一定量的粗制原花青素，經(jīng)DM301型大孔樹脂純化后真空冷凍干燥。

1.2.2 緩沖液的配制 鄰二氮菲(2.25mmol/L); Fe2SO4(2.25mmol/L);H2O2(0.03%);pH=7.4磷酸緩沖液PBS(0.2mol/L);pH=7.4，0.2mol/L磷酸緩沖液PBS配制:取0.2mol/L磷酸二氫鈉19mL，0.2mol/L磷酸氫二鈉81mL混勻。

鄰苯三酚(3mmol/L);pH=8.2的Tris－HCl緩沖液(50mmol/L);pH=8.2，50mmol/L Tris－HCl緩沖液的配制:取0.1mol/L的Tris溶液50mL，0.1mol/L鹽酸22.9mL，蒸餾水27.1mL混勻。

1.2.3 抗羥自由基的能力

1.2.3.1 原理 鄰二氮菲與二價(jià)亞鐵離子生成紅色絡(luò)合物，在511nm下有最大吸收波長。在體系中加入雙氧水，由于雙氧水將二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子產(chǎn)生羥自由基，從而使紅色減退，故吸光值將減小。若在反應(yīng)體系中同時(shí)加入雙氧水和抗氧化劑(如維生素C或黃酮或多糖類物質(zhì))將抑制紅色物質(zhì)的減退，從而可以測定抗氧化物質(zhì)對羥自由基的清除能力。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 在試管中加入1mL鄰二氮菲，0.3mL磷酸緩沖液PBS，1mL Fe2SO4溶液后，加蒸餾水定容至10mL，在511nm下測得吸光值A(chǔ)1;在試管中加入1mL鄰二氮菲，0.3mL磷酸緩沖液PBS，1mL Fe2SO4溶液，1mL H2O2，用蒸餾水定容至10mL，在511nm下測得吸光值A(chǔ)2;在試管中加入1mL鄰二氮菲，0.3mL磷酸緩沖液PBS，1mL Fe2SO4溶液，藥液(相同濃度的原花青素或抗壞血酸)1mL，1mL H2O2，用蒸餾水定容至10mL，在511nm下測得吸光值A(chǔ)3;在試管中加入1mL鄰二氮菲，0.3mL磷酸緩沖液PBS，藥液(1mL)，用蒸餾水定容至10mL，在511nm下測得吸光值A(chǔ)4;空白試劑為(1mL鄰二氮菲+ 0.3mL磷酸緩沖液PBS+蒸餾水定容到10mL)。

1.2.3.3 羥自由基清除率的計(jì)算 清除率=(A3－A4－A2)/A1×100%

1.2.3.4 A1和A2值的確定 分別考查溫度、時(shí)間和雙氧水的濃度對(A1－A2)差值的影響，按實(shí)驗(yàn)方法，分別采用溫度為30～80℃、時(shí)間為5～30min、雙氧水濃度0.03%～3%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)(A1－A2)差值最大時(shí)，確定A1和A2的值。

1.2.4 抗超氧自由基的能力

1.2.4.1 原理 在堿性條件下(pH=8.2)，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成·和中間體，該中間產(chǎn)物在λ=320nm處有一特征吸收峰，當(dāng)加入·清除劑時(shí)·的生成受到抑制，鄰苯三酚自氧化過程受阻，溶液在λ=320nm處吸收減弱。則通過測定A320值可推斷提取液對·的清除作用。

1.2.4.2 實(shí)驗(yàn)方法 取50mmol/L，pH=8.2的Tris－HCl緩沖液4.5mL，加入4.2mL的蒸餾水，混勻后在35℃水浴保溫20min，取出后立即加入35℃水浴鍋中預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白)，混勻后立即倒入比色杯中，在320nm處每隔30s測吸光值一次，連續(xù)測定15min，計(jì)算溶液吸光值隨時(shí)間變化率FO。依上述方法，在加入鄰苯三酚之前先加入一定濃度(濃度可配成不同的梯度)原花青素1.0mL，再加入3.2mL蒸餾水，混勻后在35℃水浴鍋中預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白)，混勻后立即倒入比色杯中，在320nm處每隔30s測吸光值一次，連續(xù)測定15min。計(jì)算溶液吸光值隨時(shí)間變化率FX。

式中:FO為空白試樣吸光值隨時(shí)間變化率;FX為樣品試樣吸光值隨時(shí)間變化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗羥自由基的能力

2.1.1 最大吸收波長的確定 見圖1。

圖1 鄰二氮菲與二價(jià)亞鐵離子生成紅色絡(luò)合物在紫外/可見光譜掃描曲線

2.1.2 溫度對(A1－A2)值的影響 溫度對A1，A2的值都有影響，會(huì)隨溫度的升高而下降，但(A1－A2)的差值是先升高后降低。圖2表明在50、60℃時(shí)差值一樣，達(dá)到最大，考慮到溫度過高對反應(yīng)體系的影響，故反應(yīng)溫度選擇50℃。

圖2 溫度對(A1－A2)值的影響

2.1.3 時(shí)間對(A1－A2)值的影響 時(shí)間對A1，A2的值都有影響，但變化不是很大。(A1－A2)的差值隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，后又降低。圖3表明，10min時(shí)(A1－A2)的差值最大，故反應(yīng)時(shí)間為10min合適。

圖3 時(shí)間對(A1－A2)值的影響

2.1.4 雙氧水濃度對(A1－A2)值的影響 雙氧水濃度主要是影響A2的值，隨著雙氧水濃度的增加，A2的值不斷下降，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)下降趨勢逐漸平緩。(A1－A2)值隨A2值的下降而升高，圖4表明，當(dāng)雙氧水濃度達(dá)到1.2%時(shí)，(A1－A2)值最大，再提高雙氧水濃度，(A1－A2)值的變化不大，所以雙氧水濃度選擇1.2%較為合適。

2.1.5 A1，A2值的確定 溫度50℃，雙氧水濃度1.2%，反應(yīng)時(shí)間10min，通過平行實(shí)驗(yàn)組確定A1，A2的值。A1=0.783，A2=0.210。

圖4 雙氧水濃度對(A1－A2)值的影響

2.1.6 馬尾松樹皮中原花青素提取物清除·OH自由基的能力 從圖5中可以看出，隨著原花青素提取物溶液的濃度升高，溶液對·OH清除率也在不斷上升。而且，精制原花青素的抗氧化能力明顯強(qiáng)于粗提物，同時(shí)不管是精制還是粗制原花青素都比抗壞血酸的抗氧化能力要強(qiáng)很多。從圖中還可以得出，精制和粗制原花青素除·OH自由基的EC50分別為0.022mg/mL，0.035mg/mL。

圖5 ·OH自由基的清除率

2.2 抗超氧自由基的能力

2.2.1 最大吸收波長的確定 見圖6。

圖6 堿性條件下鄰苯三酚自氧化反應(yīng)物在紫外/可見光譜掃描曲線

圖7 超氧自由基(O－2·)的清除率

3 討論與結(jié)論

［1］張冰若，勞業(yè)興，蘇薇薇.原花青素的研究現(xiàn)狀及開發(fā)前景［J］.中藥材，2003，26(12):905.

［2］田云，盧向陽，易克，等.天然植物抗氧化劑研究進(jìn)展［J］.中草藥，2005，36(3):468.

［3］Da Siva RJM，et al.Proanthocyanidin dimers and trimers from grape Seeds［J］.Photochemistry，1994，30(4):1259.

［4］林春蘭，蔣建偉，吳美玉，等.松樹皮原花青素的離體抗氧化作用［J］.中藥材，2001，24(12):882.

［5］Marandino C.An ounce of prevention［J］.Better Nutrition，2000，62(10):4.

［6］賴斐，謝衡，王金發(fā).松樹皮提取物Pycnogenol的生物學(xué)和疾病防治功能研究進(jìn)展［J］.中草藥，2005，36(1):127.

［7］李海濤，張良，盛玉清，等.松樹皮原花青素的抗腫瘤作用研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(1):43.

Study on the in vitro anti－free radical of procyanidins from the bark of pinus massoniana

WANG Qiu－yue，YU Jian－ping*，CAI Li，YANG Wen－kun，SHEN De－yan
(Institute of Biochemistry and Nutrition，Guizhou University，Guiyang 550025，China)

Objective:The in vitro anti－free radical of procyanidins from the bark of pinus massoniana was studied. Methods:Compared with the ascorbic acid and superoxide radical，used orthophenanthroline and pyrogallol spectroscopy to estimate the ability of anting hydroxyl free radical and superoxide radical.Results:Procyanidins from the bark of pinus massoniana exhibited obvious scavenging effects for hydroxyl free radical and superoxide radical. Besides，procyanidins was obviously higher than ascorbic acid and superoxide radical，respectively.

pinus massoniana;procyanidins;anti－free radical;hydroxcyl free radical;superoxide radical

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0081－03

2009－09－03 *通訊聯(lián)系人

王秋月(1982－)，女，碩士研究生，研究方向:應(yīng)用生物化學(xué)與生化分離工程。