基于強制滲透法制備天然水溶性殼聚糖的研究*

劉廷國，王彬彬，査萍萍，陳建，李斌

1(華中農業大學食品科技學院，湖北武漢，430070)2(池州學院化學與食品科學系，安徽池州，247100)3(池州市食品藥品檢驗所，安徽池州，247000)

基于強制滲透法制備天然水溶性殼聚糖的研究*

劉廷國1，2，王彬彬1，査萍萍3，陳建1，李斌1

1(華中農業大學食品科技學院，湖北武漢，430070)2(池州學院化學與食品科學系，安徽池州，247100)3(池州市食品藥品檢驗所，安徽池州，247000)

制備非衍生化高相對分子質量水溶性殼聚糖對材料創新及應用具有重要的意義。采用真空強制滲透法，使濃堿強制滲透入甲殼素顆粒的微孔中，加速甲殼素的溶脹以及NaOH的傳質，形成近似均相的脫乙酰環境。通過控制脫乙酰度在50%左右，即可獲得水溶性殼聚糖。表觀黏度、紅外光譜、X－射線衍射、差示掃描量熱分析表明:制備的水溶性殼聚糖與傳統殼聚糖無本質差異;所不同的是，強制滲透法制備的產品呈非晶態，分子間氫鍵作用較弱，因而具有良好的水溶性。

強制滲透，水溶性殼聚糖，均相脫乙酰，非衍生化

殼聚糖是甲殼素［1－3］的部分 N－脫乙酰產物，由性質活潑的伯胺基取代了化學惰性的乙酰氨基，使殼聚糖具有良好的生物相容性、廣譜抗菌性、生物可降解性、重金屬離子螯合性、成膜性和成纖維性等［4－5］，因而使甲殼素、殼聚糖及其衍生物在生物醫用材料、廢水處理、紡織印染、食品、化妝品和農業等領域均有很高的應用價值［6－7］。然而由于穩定的結晶結構致使甲殼素和殼聚糖不能溶于中性水溶液，也不能溶于一般有機溶劑，這極大地制約了其應用［8－9］，有效解決其溶解性問題，成為備受關注的熱點之一［10－11］。

目前，水溶性殼聚糖的制備主要有3種途徑:(1)在溫和的均相條件下，利用甲殼素脫乙?；驓ぞ厶且阴；?，控制脫乙酰度(degree of deacetylation，DDA)在50%左右即可獲得水溶性殼聚糖［12－13］;(2)利用甲殼素分子結構中的羥基和氨基的反應活性，在其分子主鏈上引入親水基團，通過化學修飾得到水溶性衍生物［14］;(3)通過超聲、高能射線輻射、酶水解等物理或化學方法降解殼聚糖得到低分子質量的水溶性產物［10，15－16］。然而只有第一種方法制備的產物才是真正意義上的水溶性殼聚糖。但由于均相反應條件不易控制，后處理冗長繁瑣，需要消耗大量有機溶劑等缺點，導致該方法難以推廣［17］。本研究在傳統制備方法的基礎上利用真空將NaOH強制滲透進甲殼素顆粒內部，創造近似均相的環境，從而制備非衍生化水溶性甲殼素。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

甲殼素(食品級，DDA=21.11%，過80目篩)，浙江金殼生物化學有限公司;殼聚糖(DDA=87.5%，Mη =6.95×105，80目)、除特別說明外，實驗用水均為雙蒸水，所用化學試劑均為分析純。

數字旋轉黏度計(NDJ－8S)，上海精密科學儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋(HH－4)，國華電器有限公司;真空干燥箱(DZF－6050)，上海精宏實驗設備有限公司;冷凍離心機(BC－010_TY2265)，美國Beckman公司;分析天平(AC2105)，德國Sartorius公司;循環水式多用真空泵(SHB－III)，鄭州長城科工貿有限公司;X－射線衍射儀(D/Max－IIIA)，日本 Rigaku公司;紅外光譜儀(NEXUS 470 FT－IR)，美國 Nicolet公司;差示掃描量熱儀(204－F1)，德國Netzsch公司。

1.2 水溶性殼聚糖的制備

參照文獻［18－19］方法并作適當修改，稱取5g甲殼素樣品與質量分數45%的NaOH溶液按1∶5(g∶mL)的比例混合均勻，真空脫氣至無氣泡產生，－0.1 MPa真空度下維持3h，于40、60、84℃條件下恒溫攪拌15、20、30、45、60 min，迅速冷卻至室溫，以4 000 r/min離心20 min以除去多余的NaOH溶液，沉淀用體積分數70%乙醇洗滌至用0.1mol/L AgNO3檢測無Cl－殘留，再分別用體積分數95%乙醇、無水乙醇脫水，60℃真空干燥24 h，取出研磨置干燥器備用。

1.3 脫乙酰度和水溶性測定

脫乙酰度按文獻［19］報道方法進行測定。樣品水溶性采用濾紙稱重法測定［17］。將100.0 mg干燥樣品分散至 10mL去離子水中，4℃攪拌 24 h，用0.45μm濾紙過濾、洗滌、干燥。樣品水溶性用濾紙前后質量之差比上樣品質量來表示。

1.4 表觀黏度

分別稱取一定質量殼聚糖和水溶性樣品，分散至0.1mol/L乙酸溶液中，室溫攪拌4h使其充分溶解，配置濃度為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的殼聚糖乙酸溶液，以NDJ－8S數顯黏度計(3號轉子，30r/min)測量其表觀黏度。取濃度為1%的殼聚糖和水溶性殼聚糖(WSC)乙酸溶液，分別置 30、40、50、60、70℃恒溫水浴保溫30 min，取出立即測定表觀黏度，評價溫度的影響。取一定質量的WSC分別用去離子水配置成濃度為 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 的溶液，按前述方法測定表觀黏度。

1.5 結構表征

粉末X－射線衍射圖譜由X－射線光譜儀獲得，測定條件為 20℃，35kV，30mA，石墨單色器，DS/SS=1°，RS=0.3 mm，采用 Cu Kα1 輻射 λ =1.54184?。掃描角度(2Theta，2θ，°)范圍為 4～60°，步進 0.02°，每分鐘 4°［20］。

傅立葉變換紅外光譜(FT－IR)由FT－IR光譜儀在室溫、干燥條件下掃描獲得，掃描范圍為4 000～400cm－1，分辨率4cm－1，累加 32 次，以空氣為背景，每個樣品掃描前扣除背景［21］。

差示掃描量熱(differential scanning calorimetry，DSC)儀用純金屬銦(99.99%)校正溫度和熱焓，準確稱取(5.0±0.1)mg樣品放入蓋子中心帶孔的鋁坩堝中，密封，用相同的空坩堝作參比，以20℃/min升溫速率從30℃升至190℃，恒溫5 min?？焖倮鋮s后重新稱量，再以10℃/min從30℃升溫至500℃，整個過程均在干燥N2下進行，吹掃氣流量20mL/min，保護氣流量 60mL/min［22－23］。

2 結果與分析

2.1 水溶性殼聚糖的制備

傳統的甲殼素脫乙酰反應可視為典型的液固復相反應，符合準一級反應動力學方程。由于甲殼素的強氫鍵相互作用，導致顆粒內部無法與高濃度的NaOH充分接觸，致使局部未脫乙?；?，脫乙酰過程主要集中在甲殼素的無定形區域，乙酰基團在分子鏈上呈塊型(block－type)分布，溶解度較差。本研究借助真空的作用強制NaOH滲透進甲殼素顆粒內部，形成近似均相的環境，從而使脫乙酰反應能夠均勻進行。

圖1反映了反應溫度和時間對甲殼素脫乙酰進程的影響。隨反應溫度的提高，脫乙酰度逐漸增大。溫度越高，分子運動性越強，NaOH與反應物活性基團間的碰撞越充分，反應速度越快。此外，脫乙酰反應是吸熱反應，升高溫度，甲殼素的脫乙?；磻俾侍岣撸_到相同脫乙酰度所需的反應時間縮短。但溫度也不能過高，否則導致脫乙酰速度過快，無法使乙?；桶被鶆蚍植?。反應溫度為40℃和60℃的樣品，隨處理時間的延長脫乙酰度呈線性遞增，反應符合準一級反應動力學方程［19］。反應溫度為84℃的樣品，反應時間45 min以內呈線性遞增，在整個范圍內則呈指數增長。

圖1 溫度和時間對甲殼素脫乙酰反應的影響

對產物的水溶性測定結果顯示，只有84℃處理45 min的樣品(DDA=51.92%)能夠在純水中部分溶解(Ws=69.72%)，其他樣品只能溶脹或溶解極少部分。該樣品在水中溶解度大幅提高的原因可能是，由于甲殼素顆粒內部存在大量微小空隙，使高濃度的NaOH溶液很難穿過這種氣孔屏障，利用真空強制滲透能夠打破這種氣孔阻塞的狀祝，使NaOH逐步擴散至顆粒內部乃至核心區域，使甲殼素在近似均相的條件下脫乙酰，此時得到的殼聚糖是葡糖胺單元與乙酰葡糖胺單元的無規共聚物，氨基(—NH2)和乙酰氨基(—NHCOCH3)呈無序分布，氫鍵相互作用減小，從而使產物具有良好的水溶性。相反，其他條件制備的殼聚糖，由于乙酰胺基的分布不夠均勻，分子間作用較強，無法在純水中溶解。

2.2 殼聚糖和WSC溶液表觀黏度(η)分析

2.2.1 濃度對表觀黏度的影響

高分子聚合物溶液根據其濃度可劃分為極稀溶液、稀溶液、亞濃溶液和濃溶液。在不同的濃度區間，其分子之間存在明顯不同的相互作用，這種作用直觀地反映在高聚物的表觀黏度上。通過表觀黏度的測定還可以粗略的反映樣品分子量的大小。圖2為不同濃度殼聚糖和WSC乙酸溶液的表觀黏度，利用冪函數擬合，相關系數較好，兩者表觀黏度無顯著性差異。說明制備的水溶性殼聚糖與商品殼聚糖相似似，分子量比較接近，均為中黏度殼聚糖，在作為膜材料、增稠等方面使用更為方便。這與低分子質量水溶性殼聚糖相比為一顯著優勢。

圖2 不同濃度殼聚糖和水溶性殼聚糖乙酸溶液的表觀黏度

2.2.2 WSC 水溶液的表觀黏度

與稀乙酸相比，水為殼聚糖的不良溶劑，傳統方法制備的殼聚糖無法溶解，本研究制備的水溶性殼聚糖在水中從溶脹到溶解的過程亦較長。溶解時黏度亦較大，隨濃度的提高，黏度急劇增大，配制3%濃度以上的溶液十分困難。用指數函數A1×exp(－x/t1)+y0擬合表觀黏度與濃度的關系曲線如圖3所示。濃度為1%的水溶液的表觀黏度約為同濃度稀酸溶液的20倍。可能是在2種溶劑中，水溶性殼聚糖分子的遠程結構不同導致的。在稀酸中殼聚糖以鹽的形式存在，氫鍵作用大大減弱，黏度降低，假塑性流體特征不明顯。而在水溶液中殼聚糖分子間氫鍵相互作用強烈，分子相互纏繞，內摩擦力增大，黏度隨之提高，假塑性流體特征明顯。

圖3 不同濃度水溶性殼聚糖水溶液的表觀黏度

2.2.3 溫度對表觀黏度的影響

圖4反應溫度對殼聚糖和水溶性殼聚糖表觀黏度的影響。溫度是分子無規則熱運動激烈程度的反映，溫度升高，分子熱運動加劇，分子間距增大，材料內部自由體積增多，使鏈段更易于活動，內摩擦減少，黏度下降。相比而言，水溶性殼聚糖和商品殼聚糖的乙酸溶液黏度對溫度的敏感性相似，進一步說明，以乙酸為溶劑時，二者在應用上相似。經冪函數擬合后(如圖4)，水溶性殼聚糖對溫度的敏感性稍弱，說明在WSC在某些方面比傳統殼聚糖更優越。

圖4 溫度對殼聚糖和水溶性殼聚糖表觀黏度的影響

2.3 水溶性殼聚糖結構表征

2.3.1 紅外光譜分析

甲殼素和殼聚糖的主要差別在于，其所含酰胺基團和伯胺基團的量不同，這一差別能夠在紅外光譜中反映出來。圖5分別給出了甲殼素、殼聚糖和WSC的FT－IR圖譜。WSC 3 446cm－1附近代表O—H和N—H伸縮振動的吸收峰變寬并向低波數方向移動。波數為3 267和3 103cm－1代表N－H伸縮振動(酰胺Ⅲ帶)的吸收峰明顯減弱，幾乎不可見。這2個吸收峰與C(2s1)NH…O=C(73)和C(61)OH…HOC(62)分子內氫鍵作用關系密切［9］，可見，利用強制滲透法制備的WSC分子內氫鍵作用明顯減弱。與甲殼素相比，1 660(酰胺Ⅰ)、1 560(酰胺Ⅱ)和 1 310cm－1(酰胺Ⅲ)處3個酰胺(HN－C=O)的3個特征吸收峰有所減弱，但強于殼聚糖。波數為1 070和665cm－1處的紅外吸收是殼聚糖的結晶敏感吸收帶［24］，水溶性殼聚糖在該處的吸收明顯變寬、變弱，說明水溶性殼聚糖結晶性較差，而其他樣品在該處均有明顯的紅外吸收。

2.3.2 X 射線衍射分析

圖6為甲殼素、殼聚糖和水溶性殼聚糖的X射線衍射圖譜。甲殼素在整個掃描范圍有非常強的尖銳衍射峰，這是由于甲殼素分子鏈的規整性好并且具有剛性，可以形成較強的分子內和分子間氫鍵，使得甲殼素具有較好的結晶結構。殼聚糖在掃描范圍內也有2個較強的衍射峰。而水溶性殼聚糖在整個掃描范圍內只有一個寬化的、彌散的、無定形峰，說明水溶性殼聚糖的結晶性顯著下降，分子間的氫鍵作用明顯減弱，擾亂了分子排列的規整性，導致剛性減弱，水溶性增加。強制滲透法制備的水溶性殼聚糖結晶性較差的主要原因，是在近似均相條件下脫乙?；磻请S機進行的，每個甲殼素環上的乙酰氨基發生反應的幾率是相同的，因此得到的產物是葡糖胺單元與乙酰葡糖胺單元的無規共聚物。而在非均相條件下，甲殼素脫乙酰反應首先發生在非晶區，因此得到的產物是葡糖胺單元與乙酰葡糖胺單元的嵌段共聚物，產物仍然具有較好的結晶性。

圖5 甲殼素、殼聚糖和水溶性殼聚糖的紅外光譜圖

圖6 甲殼素、殼聚糖和水溶性殼聚糖的X射線衍射圖

2.3.3 熱特性分析

圖7是甲殼素、殼聚糖和水溶性殼聚糖的DSC及其一階微分曲線(DDSC)。甲殼素的熱分解過程是典型的吸熱過程，殼聚糖和WSC則是典型的放熱過程。甲殼素的分解峰值溫度為397.80℃，峰型較寬。而殼聚糖和WSC則出現尖銳的放熱峰，峰值溫度分別為310.54℃和297.03℃。與甲殼素相比，分解峰值溫度大大提前，說明熱穩定性比甲殼素差得多。可能是由于殼聚糖中較多自由胺基的存在導致熱穩定性降低，另一方面也可能因為分子柔性的增強，鏈段運動的增強而導致熱分解速度顯著加快。水溶性殼聚糖的分解溫度明顯低于殼聚糖，可能是由于水溶性殼聚糖分子中氨基和乙酰胺基的無規分布導致結晶性比殼聚糖低得多，分子內和分子間的相互作用力也相對較弱，熱穩定性變差。

圖7 甲殼素、殼聚糖和水溶性殼聚糖的DSC(DDSC)圖譜

3 結論

在真空條件下將濃堿強制滲透入甲殼素顆粒的微孔中，有利于加速甲殼素的溶脹以及NaOH的傳質過程，達到近似均相的脫乙酰狀態?？刂泼撘阴６仍?0%左右，所得殼聚糖具有良好的水溶性。該產物與商品殼聚糖在表觀黏度、黏均分子質量、熱分解行為等方面無顯著差異。水溶性殼聚糖熱分解溫度提前，結晶性降低，說明水溶性殼聚糖可能是葡糖胺單元與乙酰葡糖胺單元的無規則共聚物，氨基和乙酰氨基呈無序排列，分子內與分子間的相互作用力減小，導致熱穩定性降低，水溶性大幅提高。說明強制滲透法是一種較簡便、高效的制備水溶性殼聚糖的新方法，值得進一步深入研究和開發。

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Prepartion and Characterization of a Natural Water-soluble Chitosan on Forced Penetration Method

Liu Ting－guo1，2，Wang Bin－bin1，Zha Ping－ping3，Chen Jian1，Li Bin1
1(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)2(Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China)3(Chizhou Institute for Food and Drug Control，Chizhou 247000，China)

Preparation of nonderived water－soluble chitosan with high molecular weight is of great significance to the innovation of materials and its application.In this paper，the forced penetration method for preparing a natural water－soluble chitosan have been investigated.Under the action of vacuum，the concentrated alkali was forced to infiltrate into the micropore of chitin particles.This has accelerated the swelling of chitin，as well as the mass transfer process of NaOH，and thus form an approximate homogeneous environment of deacetylation.By controlling the degree of deacetylation of about 50%，a water－soluble chitosan(WSC)can be obtained.The apparent viscosity，FT－IR，X－ray diffraction(XRD)and differential scanning calorimetry(DSC)were applied to estimate the structure and properties of WSC.The results showed that water－soluble chitosan and the traditional chitosan have no essential difference.The difference is that the WSC prepared with forced penetration method has more amorphous structure，weakened intermolecular hydrogen bonds and good water solubility.

forced penetration，water－soluble chitosan，homogeneous deacetylation，nonderived

碩士，講師(李斌教授為通訊作者)，E－mail:Libinfood@mail.hzau.edu.cn)。

*國家“863”資助項目(2007AA10Z310);2011年度安徽高等學校省級自然科學研究一般項目和池州學院化學材料與工程省級實驗中心建設項目資助

2010－06－30，改回日期:2010－10－28