無錫他汀分離式分段發酵初步研究

牟琳，諸葛斌，方慧英，諸葛健

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室和工業微生物研究中心，江蘇無錫，214122)

無錫他汀分離式分段發酵初步研究

牟琳，諸葛斌，方慧英，諸葛健

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室和工業微生物研究中心，江蘇無錫，214122)

無錫他汀是一種新型HMG-CoA還原酶抑制劑，由洛伐他汀經擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)轉化產生的產物之一。轉化產物Ⅰ則作為洛伐他汀轉化為無錫他汀的中間產物，是影響無錫他汀生成及其產量的關鍵因素。研究發現，發酵過程中2種產物形成時的pH值有所不同。為提高無錫他汀產率，研究以pH值為主要調節因素，對發酵過程pH值調節、菌體補加和pH值協同調節，以及分離式分段發酵工藝進行了較全面的考察。結果表明，分離式分段發酵模式最好，即將產物Ⅰ分離提純后作為底物再次發酵生成無錫他汀，2個階段的pH值分別為7.5和5.5。同時也考察了金屬離子對發酵的影響，研究表明，Fe2+、Mg2+和Cu2+對2種產物的生成均有一定促進作用。經策略優化，無錫他汀轉化率提高15%，縮短了發酵時間，并使最終產物更易純化。這種利用同菌株分離式分段發酵模式廣泛為生成過程中存在中間產物或發酵時間較長的發酵過程的研究提供參考。

無錫他汀，同一菌株分離式分段發酵，pH值控制策略

他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國內外研究的熱點［1］。無錫他汀是由洛伐他汀經擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)ST 2710 轉化產生［2］。通過體外檢測洛伐他汀及其轉化產物對HMG-CoA還原酶活性的抑制作用，發現洛伐他汀對酶的IC50(他汀類物質抑制HMG-CoA還原酶活力50%時所用他汀類物質的量)為805.72μg/mL，而無錫他汀的IC50為202.17μg/mL，抑制作用為洛伐他汀的4倍，是一種新型高效羥甲基戊二酰酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑［3］，具有廣闊的應用價值。

前期研究表明，洛伐他汀通過生物轉化而來的轉化產物Ⅰ和無錫他汀在發酵產量上存在著偶聯關系，并初步確定該生物轉化過程分為2個階段［4］。此類產物的生物轉化若采用常規發酵工藝對于產物的生成與產率可能產生負面影響，其主要原因可能是轉化途徑上相關酶的酶促最適條件存在差異，如pH、離子及反應體系成分等，而且，在某種環境下，以不同底物進行代謝和轉化時，細胞需要做生理上的調整，這不僅會影響轉化效率，而且由于細胞的調整導致發酵過程時間延長。本研究根據無錫他汀的轉化特點，通過對發酵過程pH調節、菌體補加和pH協同調節，以及分離式分段發酵工藝進行了較全面的考察，嘗試了一種同菌株的分離式分段發酵工藝，獲得了良好的轉化效果，這不僅為提高無錫他汀的生產與進一步研究打下了基礎，而且該工藝可以為某些轉化過程中存在中間產物累積且轉化效率低、發酵時間較長的發酵產品提供一種解決途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株

擬無枝酸菌ST2710(Amycolatopsis sp.ST2710)，從自然界分離，本中心保藏。

1.2 培養基

A.高氏合成1號液體培養基(g/L):KNO31，無水K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，可溶性淀粉20，去離子水 1 000mL，pH 7.2～7.4

B.轉化培養基(g/L):可溶性淀粉50，Hycase SF 2，玉米漿5，去離子水1 000mL

1.3 產物Ⅰ的制備

轉化培養基加底物后20h，產物Ⅰ大量生成而無錫他汀還未形成時離心濃縮，以大孔吸附樹脂為柱填料，甲醇為洗脫劑進行階段式洗脫，并收集富集產物Ⅰ的洗脫液，濃縮后微孔膜過濾除菌備用。

1.4 培養方法

種子培養:將斜面Amycolatopsis sp.ST 2710接種到種子培養基(250mL三角瓶裝50mL)中，28℃靜止培養48 h。

孢子懸浮液的制備:種子液通過2層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集的濾液為孢子種子液。

搖瓶發酵條件:10%接種量接入轉化培養基中，回轉式搖床150 r/min，30℃培養48 h后，加入洛伐他汀溶液，繼續轉化48h至發酵結束。

1.5 高效液相色譜紫外檢測分析(LC-UV)

色譜柱為 Kromasil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流動相為甲醇-0.5%乙酸(80∶20);流速為1mL/min;柱溫25℃;進樣量20μL;檢測波長237 nm。

2 結果與分析

2.1 無錫他汀轉化過程中pH產生的影響

pH是無錫他汀生物轉化的主要影響因素之一，利用HPLC對轉化過程的產物和pH進行測定，發現產物Ⅰ形成期最適pH呈弱堿，無錫他汀出現和累積處于pH為酸性階段，pH大約在20h以后開始下降。2產物生成過程及pH變化如圖1所示。

圖1 兩產物生成過程HPLC分析圖

2.2 發酵過程中的pH值兩段控制

由于發酵過程中2種產物產生時的pH有所不同，研究根據報道嘗試采用pH值兩階段控制策略［5］。

在產物生成的發酵過程中，在無錫他汀形成初期將發酵液 pH 值調節為 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，發酵結束后取樣檢測。

結果表明(圖2)，pH值調至偏酸性時，無錫他汀的轉化率與偏堿性時相比有提高，這與無錫他汀需在偏酸性條件下形成的推論相同，而且當pH值調節為5.5時，轉化率比自然發酵提高了3%。由此可見在發酵轉化過程中調節pH對于無錫他汀的轉化有利。

圖2 pH值對無錫他汀轉化率的影響

2.2 菌液補加與pH值協同調節

為進一步提高產物I向無錫他汀的轉化，縮短由于菌體在pH值變化時的生理調整期，在發酵中調節pH值的同時補充新鮮的菌液，結果如圖3所示。

圖3 加入新鮮菌液并調節pH值對無錫他汀轉化率的影響

結果表明，轉化率最高出現在pH值5.5，轉化率比對照提高4%。原因可能是新加入的菌體沒有經過產物Ⅰ形成期弱堿性環境中的培養期，無法直接發揮轉化作用，或以上因素對于發酵轉化率有一定影響，但并非主要影響因素。

2.3 分離式分段調節pH值

為了進一步提高產物轉化率，采取了分離式分段發酵模式:將孢子懸浮液按10%的接種量接入轉化培養基一號中，回轉式搖床30℃培養48 h后，加入洛伐他汀溶液，轉化20 h后將發酵液在4℃下8 000 r/min離心，取上清液。利用大孔吸附樹脂分離提純產物Ⅰ，收集富集產物的洗脫液旋轉蒸發并微孔過濾除菌備用。將提純的產物Ⅰ作為底物再次轉化15 h，生成無錫他汀。

檢測結果表明，無錫他汀的生成率有明顯提高。進一步研究pH值對2種產物的形成影響:在底物轉化第1階段和第2階段，即產物Ⅰ生成期和無錫他汀生成期，將轉化培養基的pH值分別調成4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。

由圖4可見，2個階段的最適pH值有較大差異。產物Ⅰ的形成階段最適pH值為7.5，原因可能是大多。單加氧酶的最適pH值均在中性或偏堿性［6－7］;而無錫他汀形成期pH值為5.5時，與原發酵方法相比，轉化率也提高了13%，同時由產物Ⅰ轉化為無錫他汀的時間明顯縮短。因此，分離式分段發酵模式具有較明顯的優勢。

圖4 pH值對兩步轉化過程的影響

2.4 金屬離子對兩步轉化過程的影響

金屬離子是微生物生長過程中所需要的微量元素，對菌體的生長及部分酶的活性都有一定的影響［8－9］。實驗考察了在發酵培養基中添加部分金屬離子對兩步轉化過程的影響情況。

圖5 金屬離子對兩步轉化的影響

由圖可見，Fe2+、Mg2+和Cu2+對于兩步轉化均有一定的促進作用。其中Fe2+是許多單加氧酶所含血紅素的組成部分，添加該離子有利于氧的結合和電子傳遞，從而提高產率［10］;Mg2+和 Cu2+則有利于酶的穩定。3種對發酵有促進作用的金屬離子對于2種產物的最適添加量有所不同，2個階段分別通過3因素3水平正交試驗進一步確定2種產物生成時上述3種金屬離子添加量(表1)。

表1 正交試驗結果

最終結合pH值調節及金屬離子的添加，在分離式分段發酵模式下，無錫他汀的轉化率提高了15%。

3 討論

本研究通過改進獲得了分離式分段發酵轉化無錫他汀的方法，即第一階段在pH為7.5、c［Fe2+］濃度0.857 mmol/L、c［Mg2+］0.257 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L的轉化培養基發酵產物Ⅰ，產物Ⅰ經分離提純由已培養好菌體在 pH 為 5.5，c［Fe2+］1.429 mmol/L、c［Mg2+］0.429 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L 的發酵條件下生成無錫他汀。此發酵模式使得無錫他汀的轉化率較原有傳統發酵模式提高了15%。

pH值作為影響發酵水平的重要理化因素，在不同微生物甚至同一微生物的不同生長階段對生物生長代謝起重要作用，pH值的調節是優化發酵的主要手段。對于存在中間產物的發酵過程，為了提高目標產物的產量而通常采用改變發酵條件，研究主要集中在發酵過程中不同階段的條件調節［5］，即分段控制發酵。對于需要利用不同菌通過二步或三步順序發酵生產目標產品的工藝稱為分步發酵，例如兩步法發酵生成1，3-丙二醇［11］。本文以同一菌株兩步不同pH值和離子濃度進行分離發酵生產無錫他汀取得了良好的效果，這種發酵模式可以為生成過程中存在中間產物積累且轉化條件存在差異的的發酵過程的優化提供借鑒。

［1］董亞琳，董衛華.他汀類藥物的研究進展［J］.中國新藥雜志，2003，12(3):175－178.

［2］諸葛鍵，方慧英，于海.一種擬無枝酸菌及其生物轉化洛伐他汀為無錫他汀的技術［P］.CN，200410044893.6.

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［6］華紹烽，李樹本，辛嘉英，等.一個Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷單加氧酶羥基化酶的分離純化和理化性質［J］.生物工程學報，2006，22(6):1 007－1 012.

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Studies on Separative Subsection Fermention of Wuxistatin

Mou Lin，Zhuge Bin，Fang Hui-ying，Zhuge Jian
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education Research Center of Industrial Microorganisms，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Wuxistatin was a novel inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutary(HMG)-CoA reductase which was the rate-limiting enzyme in the process of cholesterol synthesis.Amycolatopsis sp.ST2710 could convert lovastatin into wuxistatin.ProductⅠ，as the intermediate，was the key factor of producing wuxistatin.It was found that two products had different optimum pH.To increase the yield，the study took pH as the main factor to investigate by three ways:adjusting pH during fermentation;adjusting pH cooperated with adding fresh bacteria solution;separative subsection fermentation.Finally we found that the separative subsection fermentation had the best result.So the method was introduced:firstly，productⅠwas formed from lovastatin，pH 7.5 and pured by macroporous resin;then the conditions of fermentation were changed to pH 5.5 for transferring pured productⅠto wuxistatin.At the same time，the effect of some metal ions on transformation was studied and the result showed that Fe2+，Mg2+and Cu2+could improve fermentation level.By this way，the convertion would increase by 15%，the time was shorten by a big margin and the final product would be more easily to purify.The fermentation pattern that based on one strain could provide reference for the study of fermentation with intermediate product and long-time fermentation.

Wuxistatin separative，subsection fermentation with one strain，pH control strategy

碩士研究生(諸葛斌教授為通訊作者)。

2010－09－05