超高麥汁濃度釀造對啤酒酵母代謝的影響*

萬春艷，趙海鋒，趙謀明

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

超高麥汁濃度釀造對啤酒酵母代謝的影響*

萬春艷，趙海鋒，趙謀明

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

以11oP麥汁釀造作對比，研究了超高濃度釀造對酵母代謝的影響。結果表明，麥汁濃度升高降低了酵母利用葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的效率，其中對麥芽三糖和麥芽糖的影響較葡萄糖顯著;隨著麥汁中糖的消耗，發酵液中乙醇濃度的增加使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低，從而導致整個發酵速度減緩，發酵周期顯著延長;酵母通過在胞內大量積累海藻糖和甘油來應對高濃度麥汁所造成的高滲透壓和高乙醇環境，麥汁濃度越高積累量越大。

超高濃度釀造，高濃度釀造，酵母代謝

高濃度釀造是采用較高濃度的麥汁(＞14oP)進行發酵，在生產過程的后期用飽和的CO2脫氧水稀釋成正常濃度的啤酒的一種生產技術。利用18°P以上麥汁釀造稱為超高濃釀造(Very High Gravity Brewing，VHGB)。與普通濃度釀造相比，VHGB可在不增加糖化和發酵設備的基礎上大幅度提高啤酒產量，提高啤酒生產效率，具有明顯的經濟優勢［1］。超高濃度麥汁中含有高濃度的可發酵性糖(麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖)，導致發酵初期發酵液的滲透壓較高，發酵后期乙醇濃度較高及營養物質含量低等問題［2－3］。這些環境壓力使得酵母生長代謝受到抑制，進而滯緩或停止發酵。

目前，VHGB對酵母發酵性能影響的研究，國外集中于分析酵母某些與發酵相關的基因的表達水平上。如Mizuno［4］等通過研究1株高產乙醇低產乙酸的突變菌株，發現其與糖酵解有關的許多基因的轉錄水平大大提高;Blieck［5］等證實了酵母發酵性能的提高與某些基因的改變有關。但這些分析并不系統而且彼此之間缺乏聯系。國內則主要針對高滲透壓、高乙醇含量等某一方面對酵母性能的影響進行闡述。如董永勝［6］等以氣體為加壓介質，研究了不同壓力下酵母細胞生長特性及壓力對酵母發酵性能的影響。但在VHGB中，針對酵母細胞的代謝情況還缺乏系統的分析，而這些正是從根本上改善和提高酵母發酵性能的基礎。因此，本文系統研究了在VHGB中，啤酒酵母對可發酵性糖的利用、產乙醇情況以及胞內物質甘油和海藻糖含量的變化情況，以期從代謝和酵母的響應角度深入了解高濃釀造對酵母生理活性的影響，為啤酒高濃釀造優良菌種的選育提供理論基礎。基于這些理論指導，耐超高濃釀造的酵母菌株正在選育當中。

1 材料與方法

1.1 菌種

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FB95，華南理工大學食品生物技術研究室保藏。

1.2 麥汁制備和發酵條件

麥汁制備:1 kg麥芽粉碎，以1∶4(g∶mL)的料水比進行糖化，45℃恒溫30 min，升溫至63℃恒溫1 h，70℃恒溫10 min，碘試，78℃恒溫10 min后過濾，洗糟，105℃煮沸1.5 h。麥汁定型18oP，然后用60oP麥葡糖漿將麥汁濃度調至24oP(超高濃度麥汁)，將超高濃度麥汁分別稀釋成18oP麥汁(高濃度麥汁)和12oP麥汁(正常濃度麥汁)，121℃滅菌15 min。

發酵條件:種子擴培見參考文獻［7］;VHGB接種量為8 g(酵母泥)/L、高濃釀造接種量為6 g(酵母泥)/L、正常濃度釀造接種量為4 g(酵母泥)/L，12℃厭氧發酵。

1.3 主要設備和試劑

全自動糖化儀，杭州博日科技有限公司;低溫培養箱，上海一恒科技有限公司;7LEBC發酵管，北京德之杰啤酒科技有限公司;Waters 600高效液相色譜儀。

葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖為色譜純(Sigma公司);其他藥品為分析純;高濃麥葡糖漿(廣州珠江啤酒有限公司)。

1.4 分析方法

麥汁表觀濃度、表觀發酵度、菌體干重(DCW)、菌體活性的分析見參考文獻［8］;麥汁中糖分析:高效液相色譜法(HPLC)，色譜柱(Waters Spherisorb 5 μm NH24.6 ×250mm)，方法見參考文獻［9］; 胞內海藻糖和甘油的提取與分析見參考文獻［10］。

2 結果與討論

2.1 麥汁濃度對酵母糖利用的影響

啤酒酵母FB95是1株用于正常濃度釀造(Normal Gravity Brewing，NGB)的啤酒酵母，在低于12oP麥汁中可正常發酵，當表觀發酵度達到80%時，主發酵周期為7d(見圖1)。隨著麥汁濃度的升高，啤酒酵母FB95主發酵周期明顯延長，高濃釀造(High Gravity Brewing，HGB)時為15d，VHGB 的時為28 d。

圖1 不同濃度麥汁的降糖曲線

這是由于麥汁濃度越高，麥汁、發酵液的滲透壓和乙醇產量也相應升高，滲透壓升高使酵母形成生理干燥，乙醇濃度過高也對酵母產生毒害作用［11］，因此酵母生理活性降低，降糖速率也隨之降低，主發酵周期延長。

麥汁成分復雜，其中主要的可發酵性糖包括葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖［12］，酵母對這3種糖利用的快慢直接影響其發酵速率。為研究VHGB和HGB中發酵周期延長的深層原因，本文檢測了麥汁和發酵液中3種糖的含量，并對酵母降糖曲線進行擬合計算得到了酵母對3種糖的比吸收速率。由表1可知，在HGB和VHGB中，酵母對3種糖的最大比吸收速率和平均比吸收速率與NGB相比均有下降，VHGB下降的最大，HGB次之。在HGB中，比較最大和平均比吸收速率相對NGB的下降率發現，麥芽三糖的下降率最大(37.90%和 47.43%)，麥芽糖次之(20.34%和 44.36%)，葡萄糖最小(18.16%和46.76%)。在VHGB中，麥汁濃度進一步升高，對酵母代謝影響更加顯著，麥汁三糖的最大和平均比吸收速率下降率分別為67.75%和68.15%，麥芽糖的分別為36.51%和62.83%，葡萄糖的分別為29.54%和57.52%。上述結果表明葡萄糖與麥芽糖和麥芽三糖不同的轉運機制，酵母對麥芽糖和麥芽三糖的吸收需要能量(ATP轉化成ADP)，而葡萄糖的吸收則不需要能量［12］。因此在高濃麥汁中，酵母活性降低，對麥芽糖和麥芽三糖的利用效率顯著降低，是造成發酵后期降糖速率降低的重要原因。

表1 不同麥汁濃度對酵母利用麥汁糖的影響

2.2 麥汁濃度對酵母產乙醇的影響

由圖2(A)知，麥汁濃度越高，發酵結束時乙醇濃度也越高，VHGB、HGB和NGB的乙醇體積分數分別為11.1%、7.99%和5.14%。高濃度的乙醇使酵母細胞膜的透性和構造發生變化，引起細胞膜對H+的通透性增加，使H+大量進入細胞，降低了細胞內外的離子濃度梯度，并使細胞質的pH值下降，從而導致細胞的生理狀態發生變化，活性降低。酵母活性降低導致乙醇生成能力降低，結果見圖2(B)，在NGB、HGB和VHGB中，乙醇的比生成速率變化趨勢相同，在發酵初期比生成速率迅速下降，并隨發酵的進行進一步降低，到發酵后期基本保持不變。

2.3 酵母對高濃度麥汁的響應

啤酒釀造過程是個復雜的生化反應過程，在此過程中，酵母的發酵環境不斷變化。酵母細胞通過調控胞內的代謝情況能快速適應這些環境的變化。酵母胞內的海藻糖和甘油被認為是酵母細胞應對環境變化(乙醇濃度和滲透壓升高)最重要的2種物質［13］。

圖2 不同濃度麥汁發酵過程中酵母的乙醇濃度(A)和比生成速率(B)變化

海藻糖不僅是酵母胞內一種重要的貯藏性碳源，并且具有穩定細胞膜，使細胞具有更強的抵御外界不良環境維持正常生理功能的作用［14－16］。由圖3可知，發酵初始，酵母胞內海藻糖迅速積累，且麥汁濃度越高，積累量越大，在NGB、HGB和VHGB中，酵母胞內海藻糖的最高含量分別為6.81%、9.59%和10.88%。這是酵母對高乙醇濃度所作出的響應。隨著糖類物質的消耗，海藻糖的含量又迅速下降，原因一方面可能是海藻糖作為碳源物質被消耗，另一方面則可能是過高的滲透壓和乙醇的毒性導致細胞膜的通透性改變，影響了海藻糖的合成與積累。

圖3 不同濃度麥汁發酵過程中酵母胞內海藻糖含量變化

由圖4可知，麥汁濃度越高，所產的胞內甘油也越多，在NGB、HGB和VHGB中酵母胞內的甘油最高含量分別為8.85%、11.00%和13.08%。隨著發酵的進行胞內甘油迅速被消耗。甘油是酵母胞內最主要的相容性物質，能在胞內以高濃度存在而不對胞內的酶產生抑制或失活作用，當細胞處于高滲透壓環境中時，細胞便通過提高胞內甘油的積累來抵御胞內水分外流，維持胞內外滲透壓的平衡［14－16］。

圖4 不同濃度麥汁發酵過程中酵母胞內甘油含量變化

綜合胞內海藻糖和甘油的情況，發現在HGB中，酵母最直接的自我保護機制是通過海藻糖和甘油在胞內的大量積累來應對高濃麥汁所造成的高滲透壓環境，積累量與麥汁濃度成正相關。隨著發酵的進行，二者濃度迅速降低的原因又有所不同，海藻糖可能作為一種儲藏性碳源被消耗，甘油則可能被運輸到胞外，從而使得胞內的濃度逐漸降低。

3 結論

(1)麥汁濃度升高使主發酵周期延長，NGB、HGB和VHGB的主發酵周期分別為7、15和28 d。

(2)麥汁濃度升高影響了酵母利用葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的效率，對麥芽三糖和麥芽糖利用效率的影響比葡萄糖大，是主發酵后期降糖速率降低的重要原因。

(3)麥汁濃度升高，發酵液中乙醇濃度增加，使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低。

(4)在HGB和VHGB中，酵母胞內的海藻糖和甘油含量比NGB高，反映了酵母對高濃度麥汁的自身調控作用。

［1］彭景龍，吳振強，梁世中.啤酒高濃釀造研究進展［J］.釀酒，2009，28(5):34－35.

［2］孫向軍，姚曉敏.啤酒高濃釀造的研究［J］.食品與發酵工業，2001，27(7):19–21.

［3］O Connor-Cox E S C，Lodolo E J，Axcell B C.Role of oxy-gen in high gravity fermentations in the absence of unsaturated lipid biosynthesis［J］.Journal of American Society of Brewing Chemists，1993，51(3):97 –107.

［4］Mizuno A，Tabei H，Iwahuti M.Characterization of lowacid-producing yeat isolated from 2-deoxyglucose-resistant mutants and its application to high-gravity brewing［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，101(1):1，31–37.

［5］Blieck L，Toye G，Dumortier F，et al.Isolation and characterization of brewer’s yeast variants with improved fermentation performance under high-gravity conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(3):815–824.

［6］董永勝，楊親正，賈士儒.壓力對啤酒酵母生長及某些發酵性能的影響［J］.釀酒科技，2007(11):38–40.

［7］秦耀宗.啤酒工藝學［M］.北京:中國輕工業出版社，2008.

［8］管敦儀.啤酒工業手冊［M］.北京:中國輕工業出版社，1982.

［9］林艷，單連菊.高效液相色譜法測定啤酒、發酵液和麥汁中的糖類和乙醇［J］.山東化工，1998(5):60–62.

［10］張巖，梁萌，劉德華.克魯氏假絲酵母在高滲環境中海藻糖和胞內甘油積累的研究［J］.生物工程學報，2001，17(3):332–335.

［11］Chi Z，Arneborg N.Relationship between lipid composition，frequency of thanol－induced respiratory decient mutants，and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Applied Microbiology，1999，86:1 047－1 052.

［12］張艷艷.發酵過程酵母對麥汁糖的吸收和代謝［J］.啤酒科技，2007(5):62–65.

［13］李曉軍，徐鵬，欒靜，等.耐高滲釀酒酵母的代謝流分析［J］.食品與生物技術學報，2009，28(3):356–360.

［14］Dijck P V，Colavizza D，Smet P，et al.Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae cells［J］.Applied and Environmental Microbiology，1995，61(1):109 –115.

［15］Odumeru JA，D＇Amore T，Russell I，et al.Alterations in fatty－acid composition and trehalose concentration of Saccharomyces cerevisiae brewing strains in response to heat and ethanol shock［J］.Journal of Industrial Microbiology，1993(11):113–119.

［16］Nwaka S，Mechler B，Holzer H.Deletion of the ATH1 gene in Saccharomyces cerevisiae prevents growth on trehalose［J］.FEBS Letters，1996(386):235 –238.

Effects of Very High Gravity Brewing on the Metabolism of Saccharomyces cerevisiae

Wan Chun-yan，Zhao Hai-feng，Zhao Mou-ming
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Effects of super high gravity brewing on the metabolism of Saccharomyces cerevisiae were examined in the present study.The results showed that higher gravity of wort caused significant decreased in utilization efficiency of Saccharomyces cerevisiae for glucose，maltose and maltotriose，particularly for maltose and maltotriose.Ethanol concentration in fermentation broth increased with the consumption of sugar which then decreased the yeast activity and the production rates of ethanol，and consequently slowed down the fermentation process and prolonged the fermentation time.Yeast responded to high osmotic pressure and high－alcohol environment caused by high gravity wort by accumulating trehalose and glycerol in the intracellular.The accumulation of trehalose and glycerol in the intracellular depends on the gravity of wort.

very high gravity brewing，high gravity brewing，metabolism of yeast

碩士研究生(趙海鋒博士為通訊作者)。

*國家“十一五”科技支撐計劃項目(2008BAI63B06)廣東省科技計劃工業項目(2009A010700004，2010A010500002)

2010－05－17，改回日期:2010－09－28