代謝調控物對紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英，洪秀云

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州，510006)

代謝調控物對紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英，洪秀云

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州，510006)

黏紅酵母是一種可以生產類胡蘿卜素的單細胞真菌，番茄紅素是一種未環化類胡蘿卜素，可以運用代謝控制手段，調控和阻遏某些相關的反應，使其累積番茄紅素。作者基于紅酵母中類胡蘿卜素的合成途徑，對環化抑制劑煙堿、麥角固醇合成抑制劑酮康唑、MoG還原酶激活劑青霉素、氧化劑過氧化氫等代謝調節物的調控條件進行了研究，發現添加一定量的上述代謝調控物質確實可以促進黏紅酵母中番茄紅素的累積。試驗中采用均勻設計法優化了代謝調控的條件，研究結果表明，分別在發酵的24 h加入煙堿2.5mL/L和青霉素4 mg/L，36h時添加雙氧水1.2mL/L，60h時添加酮康唑400 mg/L，可以使番茄紅素累積量達到176.97 mg/L，是未用代謝調控時番茄紅素產量4.10 mg/L的43.2倍。

紅酵母，番茄紅素，代謝調控

番茄紅素是一種具有11個共軛雙鍵的不飽和碳氫化合物，為類胡蘿卜素的一種，是很重要的生物活性物質，在預防和治療前列腺癌、乳腺癌等癌癥，增強人體免疫功能以及心血管疾病方面有著巨大的潛力［1－3］。

目前國內外應用的番茄紅素的來源主要有2方面:植物提取法和微生物發酵法。用植物提取法制取番茄紅素，雖然原料來源廣泛易得，但是含量較低、副產物較多，原料供應受到氣候與季節的影響較大，使得生產成本較高;與此相比，微生物發酵法具有生產周期短、生產菌可通過基因改造而大幅提高產量，易于放大和工業化生產。目前，生產天然類胡蘿卜素的主要菌種有三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorular)。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產量比較低，但由于其具有營養要求簡單、生長周期短及菌體營養豐富等許多優點，具有很高的實用價值和很好的工業開發前景。

一般情況下，微生物合成的主要類胡蘿卜素，是番茄紅素經過環化和氧化等之后的衍生物，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等［4］。因此，針對類胡蘿卜素這樣的一個合成途徑［5］，可以從3方面提高番茄紅素的累積:1是要加強和促進類胡蘿卜素合成途徑，2是要控制番茄紅素后續反應的過程，阻止其環化反應，3是阻遏其他的競爭代謝途徑，使其代謝向有利于合成番茄紅素的方向進行。本文就不同代謝調節物對番茄紅素合成的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗室篩選得到的1株產番茄紅素的黏紅酵母2.27。

1.2 主要儀器和試劑

番茄紅素標準品，上海融和醫藥公司;煙堿(95%)，西安天則生物技術有限責任公司;雙氧水(含體積分數30%H2O2的水溶液)，廣州化學試劑廠;酮康唑，廣州迪越化工有限公司;青霉素，廣州美津生物技術有限公司。

SHP－450D型生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司;SKYB2112B型恒溫搖床，廣州科橋實驗技術設備有限公司;LD5－2A低速離心機，北京醫用離心機廠;2802S型紫外分光光度計，尤尼科(上海)儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀1525，Waters紫外分光檢測器2487。

1.3 培養基與培養方法

斜面活化培養基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，瓊脂20g/L，自然pH。

液體種子培養基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，自然pH。

液體發酵培養基:葡萄糖50g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，初始pH 5，核黃素 0.5 mg/L，吐溫－80 1.5%。

種子斜面活化培養:挑黏紅酵母1環，接入斜面活化培養基中，28℃培養48 h。

液體種子培養:從活化了的斜面種子中挑取培養2環，接于裝有30mL液體種子培養基的250mL三角瓶內，28℃下200 r/min振蕩培養24 h。

液體發酵培養:以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25mL發酵培養基的250mL三角瓶中，在光照條件下，28℃，200 r/min振蕩培養96 h。

1.4 生物量的測定

發酵結束后，取10mL液體發酵液轉入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀水洗后再次離心，得酵母泥，于55℃下過夜烘干，稱干質量

1.5 番茄紅素的提取

發酵結束后，參照文獻采用熱酸法破壁［8］，丙酮浸提:取發酵液10mL轉入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，沉淀水洗后得酵母泥;加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均勻后浸泡1.5 h，然后再沸水浴4 min，迅速冷卻，再4 000 r/min離心10 min，得沉淀水洗2次，離心得到菌體殘片;加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4 000 r/min下離心10 min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄紅素含量測定方法

將色素提取液用0.22μm的微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法(HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時配制不同濃度的標準品溶液，在相同條件下測定，根據峰面積制備標準曲線定量。

Waters－1525高效液相色譜儀;色譜柱為:Agilent HC C－18柱(5μm，250 mm ×4.6 mm);Binary高效泵;檢測器為:Waters－2487，Double λ Absorbance Detector;數據分析軟件:Breeze。

高效液相色譜條件:流動相為V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=10∶90，檢測波長為472 nm，流速為1.0mL/min，柱溫為 28℃，進樣量為 10μL。

2 結果與分析

2.1 番茄紅素標準曲線

準確稱量2.5 mg的番茄紅素標準品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，質量濃度為250μg/mL。再分別稀釋成 50、100、150、200、250μg/mL的質量濃度梯度，經0.22μm濾膜過濾后HPLC檢測，數據處理，得到峰面積與質量濃度的關系曲線為:y=10.892x，R2=0.998 4。

2.2 煙堿加入的不同時間對番茄紅素累積的影響

在開始液態發酵后，分別在 6、12、18、24、30 h，以2.5mL/L的添加量加入煙堿，結果如圖1所示。

圖1 煙堿的加入時間對番茄紅素合成的影響

從圖1可以看出，隨著時間的推移，加入煙堿后番茄紅素的產量先高后低，在24 h加入時達到最大值11.51 mg/L;生物量一直隨時間的延長而增大，在30 h加入時達到最大值21.44g/L。可能是由于煙堿對酵母菌細胞有一定的毒害作用，在發酵的早期加入會對黏紅酵母生長不利，因而生物量較低。綜合考慮，添加代謝調節物煙堿的時間為24 h。

2.3 酮康唑加入的不同時間對番茄紅素累積的影響

液態發酵至24 h，添加2.5mL/L的煙堿后，再分別在發酵的 48、54、60、66、72 h，以 400 mg/L 的量加入酮康唑，對黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖2所示。

圖2 酮康唑的加入時間對番茄紅素合成的影響

根據圖2可知，隨著酮康唑加入時間的推移，黏紅酵母的生物量和番茄紅素產量都先增大后減小，在發酵至60 h時加入酮康唑時兩者都達到了最大值，分別為22.04g/L和87.27 mg/L。由于酮康唑可以抑制真菌細胞膜中麥角固醇的合成，使得更多的前體物質法尼基雙磷酸酯(FPP)用于合成番茄紅素，但過早的加入酮康唑，對酵母細胞的增殖會有一定的抑制作用，因此要在發酵達到穩定期再加入，故最適宜加入時間為60 h。

2.4 青霉素加入時間對番茄紅素累積的影響

在發酵至24h時加入2.5mL/L煙堿，60h時加入酮康唑400 mg/L，然后分別在發酵的12、18、24、30和36 h，加入青霉素1 mg/L，對黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖3所示。

圖3 青霉素的加入時間對番茄紅素合成的影響

從圖3可以看出，在發酵前期添加青霉素，黏紅酵母的番茄紅素產量先增大后減小，24h時達到最大值103.33 mg/L。因此，作為MoG還原酶的激活劑的青霉素，最適宜加入時間為發酵至24h時。

2.5 雙氧水加入時間對番茄紅素累積的影響

在發酵至24h時加入2.5mL/L煙堿和1 mg/L青霉素，60h時加入酮康唑400 mg/L，然后分別在發酵的 24、30、36、42、48 h，加入雙氧水量 1.6mL/L，對紅酵母累積番茄紅素影響如圖4所示。

從圖4可以看到，隨著雙氧水加入時間的向后推移，黏紅酵母的生物量和番茄紅素產量都是先增大后減小，42 h加入雙氧水，生物量達到最大值25.98g/L;36h加入雙氧水，產量達到最大值160.96 mg/L。由于酵母細胞對于雙氧水的氧化刺激產生應激反應，從而促進了番茄紅素的合成，但如果過早的加入，此時細胞濃度較低，對其繼續增殖不利，加入時間太晚，又會消耗掉一些已經生成的番茄紅素，因此，雙氧水的最佳加入時間是黏紅酵母發酵至36 h時。

圖4 雙氧水的加入時間對番茄紅素合成的影響

2.6 各種代謝調控物質添加量的優化

從單因素實驗結果得到幾種代謝調節物的最佳加入時間點為:煙堿在發酵至24 h時加入，酮康唑在60 h時加入，青霉素在24 h時加入，雙氧水在36 h時加入。為了進一步提高其代謝調控的水平，用均勻試驗的方法對各種調節物的添加量進行了優化，各因素及水平的選取見表1。

表1 均勻設計試驗各因素及其水平

由DPS數據處理系統得到的實驗方案及實驗所得結果如表2所示。

表2 均勻設計試驗方案及結果

從表2可以看出，運用組合N1可以得到黏紅酵母生物量和番茄紅素產量的最大值，即煙堿2.5mL/L，酮康唑600 mg/L，青霉素4 mg/L，雙氧水1.2mL/L的添加量時，可以得到番茄紅素的最大產量176.97 mg/L

3 結論與討論

本文研究了紅酵母在發酵產生番茄紅素過程中，添加番茄紅素環化酶抑制劑、麥角固醇抑制劑、青霉素和氧化劑對番茄紅素生物合成的影響。實驗中以煙堿作為環化酶抑制劑的添加，可以阻遏類胡蘿卜合成中番茄紅素的環化［6］，使得番茄紅素得以累積;由于麥角固醇和番茄紅素的合成有共同的前體物質法尼基雙磷酸酯(FPP)［7］，因此酮康唑的加入抑制了麥角固醇的合成，使得更多的FPP用來合成番茄紅素［8－9］，其產量必然增加;青霉素作為MoG還原酶的激活劑，可以增加前體物質IDP的合成，促進番茄紅素的合成［10］;雙氧水為氧化劑，對黏紅酵母的刺激增強了番茄紅素的合成代謝流，才得以使番茄紅素大量積累［11］。

采用均勻試驗對幾種調節物的添加量進行了優化，結合單因素確定的最佳添加時間，得到各調節物的添加方式為:24h時加入煙堿2.5mL/L，60h時加入酮康唑600 mg/L，24h時添加青霉素4 mg/L，36h時加入雙氧水1.2mL/L，可使番茄紅素得到大量的積累，達到176.97 mg/L，是不加效應物時番茄紅素產量4.10 mg/L的43.2倍。

［1］Clinto S K.Lycopene:chemistry，biology，and implication for human health and disease［J］.Nutr Rev，1998，56(2):35－51.

［2］BramLey P M.Is lycopene beneficial to human health［J］.Phytochemistry，2000，54(3):233－236.

［3］Pohar K S，Gong M C，Bahnson R，et al.Tomatoes，lycopene and prostate cancer:a clinician＇s guide for counseling those at risk for prostate cancer［J］.World J Urol，2003，21(1):9－14.

［4］徐志強，余曉斌，鄭亞平.類胡蘿卜素代謝工程［J］.天然產物的研究與開發，2003，15(1):259－263.

［5］惠伯棣主編.類胡蘿卜素化學及生物化學［M］.北京:中國輕工業出版社，2005:41－48.

［6］徐娜，鄭珩，許激揚.環化酶抑制劑對三孢布拉霉產生番茄紅素的影響［J］.中國抗生素雜志，2006，31(6):372－375.

［7］何秀萍，張博潤.微生物麥角固醇的研究進展［J］.微生物學通報，1998，25(3):166－169.

［8］王振文，趙亞軍，郝超焰.麥角固醇生物合成抑制劑——發展歷史及其對農業的貢獻［J］.農藥，1985，18(2):38.

［9］孫淑娟，婁紅祥，孫樂群.真菌感染與抗真菌藥物［J］.食品與藥，2005，7(2):1.

［10］解書懷，余曉斌，顧秋亞.代謝途徑酶活促進劑對番茄紅素發酵的影響［J］.生物加工過程，2008，6(2):17－21.

［11］楊建明，楊安全，許激揚.效應物促進紅酵母累積番茄紅素的工藝研究［J］.藥物生物技術，2008，15(3):204－207.

［12］郭秒.類胡蘿卜素高產菌Y11的鑒定及培養條件的優化［J］.食品與發酵工業，2004，30(7):73－77.

Effect of Metabolism Regulating Agents on Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

Wang Hai-bing，Wu Xiao-ying，Hong Xiu-yun
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Techology，Guangzhou 510006，China)

Rhodotorula glutinis，a kind of caroteniod producing unicellular epiphyte，is widespread in nature.As lycopene is a carotenoid without cyclization，metabolic control means can be used to control and deter some of the related response to accumulate lycopene.On the basis of biosynthesis path of caroteniod in Rhodotorula，experiments were carried out to stduy the regulation conditions of the conditioners，such as cyclase inhibitor nicotine，ergosterol synthesis inhibitor ketoconazole，MoG reductase activator penicillin and oxidant hydrogen peroxide.We identified that lycopene was accumulated with adding this regulator above.The results revealed that the highest lycopene concentration was obtained when 2.50 ml/L nicotine，4mg/L penicillin，1.2mL/L aquae hydrogenii dioxide(30%Hydrogen peroxide)and 400mg/L ketoconazole were added respectively at 24h，24h，36h and 60h following Rhodotorula inoculation.It reached to 176.97mg/L，43.2 times of initial lycopene yield 4.10 mg/L.

Rhodotorula，lycopene，metabolic regulation

碩士研究生(吳曉英副教授為通訊作者)。

2010－08－05，改回日期:2010－06－25