酶解大蒜渣制備果葡糖漿*

黃菁，張寧，張永韜，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

酶解大蒜渣制備果葡糖漿*

黃菁，張寧，張永韜，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

采用2種商品蔗糖酶水解大蒜渣制備果葡糖漿，經過單因素試驗以及正交試驗確定了Sigma公司的蔗糖酶水解率較高。其最適酶解條件:pH值為4.8，溫度為45℃，底物濃度為8mg/mL，加酶量為210 U/mL，酶解時間為12 h。在此酶解條件下，蔗糖酶的水解率達到80%，經離子色譜-積分脈沖安培檢測法分析，酶解產物以果糖和葡萄糖為主。

蔗糖酶，大蒜渣，果葡糖漿

果葡糖漿是以果糖與葡萄糖為主要組分的健康型糖源，其中果糖含量較高。果葡糖漿的生產主要是以玉米淀粉通過淀粉酶，葡萄糖糖異構酶兩步法生產［16］，該方法純化工藝復雜，果糖含量不高。果聚糖在無機酸或酶的作用下可水解成為果葡糖漿，因此通過水解一些含果聚糖的天然原料如菊粉制備果葡糖漿成為了一條新的途徑。其中，通過酸法水解天然果聚糖原料制備果葡糖漿，果糖不穩定、風味差、色澤深，已逐漸被淘汰。而酶法水解則條件溫和，產量高，副產物少，逐漸成為研究的熱點［16］。

大蒜(Allium sativum)營養豐富，其中75%以上的干物質由碳水化合物組成，主要是大蒜果聚糖［1］。其果聚糖的果糖與葡萄糖比例約為15∶1，是制備果葡糖漿的理想原料。本文采用商品蔗糖酶制劑降解大蒜渣制備果葡糖漿，擬為生產質高，價廉的果葡糖漿開發新原料。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

市售大蒜;蔗糖酶，Sigma和裕立寶生物公司;Na2HPO4、檸檬酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、濃 H2SO4、苯酚、Na2SO3(均為分析純)，天津市福晨化工廠;3，5-二硝基水楊酸，化學純，國藥集團化學試劑廠;葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖，均為Sigma色譜純;蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，均為WAKO(日本)色譜純。

HH－4恒溫水浴鍋、SHA－B水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市宏華儀器廠;KDC－1044低速離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司;721分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;DHG－9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;DIONEX－2500離子色譜儀，配有GP50四元梯度泵，AS50自動進樣器，美國戴安。

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜渣預處理

將市售大蒜搗碎，用蒸餾水提取大蒜渣中的多糖，固液比 =1∶2，95℃下煮沸 40 min［3］，再保溫 1 h，紗布過濾，經3 500 r/min離心20 min，上清液即為大蒜果聚糖液［3］。分別測定其中總糖和還原糖的含量。

1.2.2 蔗糖酶水解大蒜多糖

2種蔗糖酶分別用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進行適當的稀釋，加入至大蒜果聚糖液中，調至pH為5.0，溫度保持在50℃，酶解12 h，得出樣品，分別測其總糖含量和還原糖含量，計算酶解得率。2種蔗糖酶均用酶活濃度、底物濃度、溫度、pH值以及時間為單因素試驗，再對較高提取率的酶選出4種差異因素做4因素3水平的正交試驗，測定最終蔗糖酶的水解率。

1.2.3 蔗糖酶酶活的測定

用pH值為4.6的乙酸鈉-醋酸緩沖液對2種蔗糖酶進行適當的稀釋，取1mL酶液加入4mL蔗糖液(濃度為0.05mol/L)，40℃準確反應10min，加入1mL 1mol/L的NaOH搖勻，終止酶促反應［2］。測定反應液中的還原糖含量，計算酶活。得出初始Sigma蔗糖酶的酶活為1 320 U/mL，裕立寶蔗糖酶的酶活為1 500 U/mL。

1.2.4 水解液中總糖的測定

苯酚-硫酸法［4］。

1.2.5 水解液中還原糖的測定

3，5-二硝基水楊酸法［5］。

1.2.6 色譜條件

1.2.6.1 單糖檢測的色譜條件

分析柱:CarboPac PA－10(4 mm ×250 mm)，保護柱:CarboPac PA－10G(4 mm×50 mm);流動相:3%250 mmol NaOH;體積流量:0.20mL/min;進樣體積:25μL;柱溫:30℃;檢測器:ED50A安培檢測器(金工作電極，Ag-AgCl參比電極，鈦對電極)。單糖標準品混合液的色譜圖如圖1。

圖1 單糖標準品混合液的色譜圖

1.2.6.2 低聚果糖檢測的色譜條件

分析柱:CarboPac PA－100(4 mm×250 mm)，保護柱:CarboPac PA-100G(4 mm×50 mm);體積流量:0.20mL/min;進樣體積:25μL;柱溫:30℃;檢測器:ED50A安培檢測器(金工作電極，Ag-AgCl參比電極，鈦對電極)。流動相的比例如表1，低聚果糖標準品混合液的色譜圖如圖2。

圖2 低聚果糖標準品混合液的色譜圖(混合液由1mg/mL的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖以1∶1∶1的體積比混合而成)

表1 流動相的比例設置

1.2.7 蔗糖酶水解率的計算

式中:m1為水解后還原糖的含量(mg);m0為水解前還原糖的含量(mg);m為樣品液中總糖的含量(mg)。

2 結果與討論

2.1 蔗糖酶水解條件

2.1.1 溫度對蔗糖酶水解率的影響

分別在 35、40、45、50、55、60℃下，pH 值為 5.0，酶解12 h，水解率如圖3所示。

圖3 溫度對水解率的影響

由圖3可以看出，當溫度由35℃升至45℃時，2種蔗糖酶的水解率都升高，50℃時，蔗糖酶的水解率達到最高，這是因為隨著溫度的升高，反應速率加快［15］。但由50℃升至60℃時，水解率驟降，這可能是由于溫度過高，導致蔗糖酶本身的熱穩定性下降［6］，從而使得蔗糖酶的活性發生變化，導致水解率降低。因此，實驗用2種酶的最適溫度都在45～50℃。

2.1.2 pH值對蔗糖酶水解率的影響

分別研究 pH 值 3.0、4.0、4.4、5.0、6.0、7.0 下，溫度為50℃，水解12 h的水解結果(如圖4)。

由圖4可知，當pH值由3升至5時，隨著pH值的增加，2種蔗糖酶的水解率小幅度的升高，但當pH值由5升至6時，Sigma蔗糖酶的水解率稍微降低，但裕立寶蔗糖酶水解率繼續升高，這是因為酶的活性中心對pH值敏感［6］，不同酶具有不同的最適pH值。當pH值由6升至7時，添加Sigma蔗糖酶的樣品水解率驟降，添加裕立寶蔗糖酶的樣品水解率也明顯下降。因此，sigma蔗糖酶和裕立寶蔗糖酶最適pH值范圍均為4.0～6.0。

圖4 pH對水解率的影響

2.1.3 加酶量對蔗糖酶水解率的影響

Sigma 蔗糖酶分別以 35、70、140、175、210 U/mL五種酶量，裕立寶蔗糖酶分別以 1.6、8、40、50、80U/mL加酶量，加入到底物濃度為12mg/mL的大蒜果聚糖液中，pH值為5.0、50℃下水解12 h，結果如圖5和圖6。

圖5 Sigma蔗糖酶的加酶量對水解率的影響

圖6 裕立寶蔗糖酶的加酶量對水解率的影響

由圖5和圖6可以看出，在反應初期，隨著加酶量的增加，2種蔗糖酶的水解率逐漸增加，這是因為隨著酶活量的增加，水解體系中的反應速率增加，提高了水解率。當Sigma蔗糖酶加酶量達到175 U/mL后，蔗糖酶的水解率增加不顯著，基本呈水平線。裕立寶蔗糖酶加酶量達到40 U/mL時，蔗糖酶的水解率較大，再增加加酶量時，水解率趨于平穩，這是因為后期水解速率減慢，水解率逐漸達到最大，因而趨于穩定［10］。因此，從水解率和經濟方面考慮，分別選擇175 U/mL、40U/mL的加酶量比較適合。

2.1.4 底物濃度對蔗糖酶水解率的影響

研究不同底物濃度 2、4、8、10、12mg/mL 的大蒜果聚糖液中，pH值為5.0時、50℃下水解12h，得結果如圖7所示。

圖7 底物濃度對轉化率的影響

由圖7可知，當底物濃度由2mg/mL升至8mg/mL時，隨著底物濃度的增加，Sigma蔗糖酶的水解率呈上升趨勢，這表明底物濃度對Sigma蔗糖酶水解率的影響十分明顯［10］;當底物濃度達到8mg/mL時，增加底物濃度，蔗糖酶水解率增加緩慢甚至不再增加。而裕立寶蔗糖酶的水解率也呈上升趨勢，但變化不顯著，這表明底物濃度對裕立寶蔗糖酶水解率的影響不顯著［14］。一般當底物濃度達到10mg/mL時，酶解率達到最高，若果聚糖濃度太高，對蔗糖酶的水解率有一定的抑制作用，甚至向蔗糖酶轉移方向發展［10］。

2.1.5 時間對蔗糖酶水解率的影響

底物濃度為12mg/mL，50℃、pH值為5.0時研究不同水解時間 2、4、6、12、18、24 h 的水解率，結果如圖8所示。

圖8 時間對轉化率的影響

由圖8可知，對于Sigma蔗糖酶，2～18 h時，隨著時間的增加，蔗糖酶的水解率呈上升趨勢，18～24 h時，單位時間內水解率沒有顯著提高。對于裕立寶蔗糖酶，2～12 h時，水解率顯著提高，12～24 h時，蔗糖酶水解率不再增加。隨著時間的延長，并不能顯著提高酶解率，原因可能是高濃度的果糖對蔗糖酶具有抑制作用［14］。因此從經濟和能耗的角度考慮，酶解時間選擇12 h。

2.2 酶解條件的優化

在單因素的試驗基礎上，可以看出Sigma蔗糖酶的水解率較高。選擇溫度(A)、pH(B)、加酶量(C)、底物濃度(D)作為考察因素，每個因素選擇3個水平做正交試驗，因素水平見表2。正交試驗結果見表3。

表2 Sigma蔗糖酶水解因素水平表

由表3的實驗數據可知，實驗號為5的正交試驗得出的水解率最高。按極差大小決定的因素主次順序為溫度＞pH＞底物濃度＞加酶量。水解溫度和pH值為主要影響因素。結合極差與方差分析，得出最佳水解率的條件是:A2B3C2D1。即溫度為45℃，pH為4.8，加酶量為210 U/mL，底物濃度為8mg/mL，水解率達到80%。

表3 sigma蔗糖酶正交試驗結果

2.3 酶解產物的成分分析

正交試驗結果顯示，Sigma蔗糖酶的水解率達到80%。取最終樣品根據色譜條件進行樣品檢測。樣品中單糖結果如圖9，樣品中低聚糖結果如圖10所示。

圖9 樣品中單糖的色譜圖

圖10 樣品中低聚糖的色譜圖

由圖10可以看出，樣品中果聚糖含量較少，酶解比較徹底，產物主要由大量的單糖組成;由圖9可以看出，樣品中單糖是由大量的果糖和少許的葡萄糖組成，其中以果糖為主，而鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及木糖含量很少;通過含量的計算，得出其中果糖含量約占樣品成分的85%，葡萄糖含量約占9%，低聚糖及少量木糖等約占6%，因此樣品中的成分以果糖為主，葡萄糖為輔;得出的含量結果與正交試驗結果相一致，因此最終樣品為果葡糖漿。

3 結論

采用2種蔗糖酶對大蒜渣進行水解，Sigma粉狀蔗糖酶的水解率略高于裕立寶的液態蔗糖酶。結果顯示，最適酶解條件是:pH值為4.8，溫度為45℃，加酶量為210 U/mL，底物濃度為8mg/mL，最終水解率可以達到80%。經離子色譜-積分脈沖安培檢測法的鑒定，酶解產物為果葡糖漿，組成成分以果糖為主，葡萄糖為輔。

［1］許春萱，魏金鳳，魏紅光.大蒜精油提取后廢棄蒜渣綜合利用的研究［J］.環境科學與技術，2001(6):42－44.

［2］鄧林.酵母蔗糖酶酶學性質的研究［J］.四川食品與發酵，2007，44(3):41－42.

［3］陳雄. 從制備大蒜精油廢棄物中提取大蒜多糖的研究［J］.食品工業科技，2007，28(1):117－119.

［4］索朗桑姆.大蒜多糖的提取分離及含量測定分析［J］.西藏科技，2004(4):22－26.

［5］陳毓荃.生物化學實驗方法和技術［M］.北京:科學出版社，2002:98－100.

［6］曾鳴，李翔.固定菊粉酶酶解菊芋提取液制備果糖的研究［J］.食品研究與開發，2 000，21(2):10－13.

［7］Nakamura T，Ogata Y，Sgutara A，et al.Continuous production of fructose syrups from inulin by immobilized inulinase from Aspergillus niger utant 817 ［J］.J Ferment Bioengineer，1995，80(2):164－169.

［8］Yun J W，Kim D H，Kim B W，et al.Production of inulooligasaccharides from inulin by immobilized endoinuliase from Pseudomonas sp.［J］.J Ferment Bioengineer，1997，84(4):369－371.

［9］Abasaeed A E，Asif M，Fakeeha A H.Zeolite–catalyzed hydrolysis of inulin to fructose in a fluidized bed reactor［J］.Bioprocess Engineering，1999(20):343－348.

［10］彭英云.Aspergillus ficuum SK004產外切菊粉酶及其酶解菊粉制備高果糖漿的研究［D］.江南大學食品學院，2005.

［12］趙國群，李秀敏，張桂.菊粉的固體酸水解［J］.食品工業科技，2007，28(9):160－162.

［13］魏文鈴.酶解菊粉法生產高果糖漿［J］.廈門大學學報，1990(5):19－21.

［14］汪倫記，董英，鄒風等.Kluyveromyces marxianus菊粉外切酶的制備及其水解菊粉的研究［J］.食品與發酵工業，2009，35(11):18－23.

［15］彭英云.菊粉的制備及殼聚糖柔性固定化菊粉酶酶解菊粉的研究［D］.江南大學食品學院，2007.

［16］王建華，劉艷艷，姚斌，等.一步法制備高果糖漿工程及產酶菌體營養價值研究［J］.食品與發酵工業，1999，26(2):1－4.

［17］Kochhar A，Gupta A K，Kaur N.Purification and immobilization of inulinase from Aspergillus candidus for producing fructose［J］.J Sci Food Agric，1999，79:549－554.

［18］Kochhar A，KaurN，Gupta A K.Inulinase from Aspergillus versicolor A potent enzyme for producing fructose from inulin［J］.J Sci Ind Res，1997，56:721－726.

［19］Uhm T B，Jeon D Y，Byun SM，et al.Purification and properities of β－fructofuranosidase from Aspergillus niger［J］.Biochim Biophys Acta，1987，362(1):119－126.

High Fructose Syrup Production by Invertase Hydrolysis on Garlic Dregs

Huang Jing，Zhang Ning，Zhang Yong-tao，Huang Xue-song
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Two sucrases were used for high fructose syrup production by hydrolyzing garlic dreg at optimal condition obtained from single－factor and orthogonal experiments.It was found that the high fructose syrup yield of 80%was achieved at pH 4.8，45 ℃，substrate concentration 8mg/mL，and enzyme concentration of 210 U/mL substrate after hydrolyzing for 12h.The hydrolysis products mainly consisted of fructose and glucose determined by ion chromatography－integrated pulsed aperometric detection.

invertase，garlic dregs，high fructose syrup

碩士研究生(張寧副教授為通訊作者)。

*國家高技術研究發展計劃專項經費(2007AA10Z300)

2010－07－06，改回日期:2010－09－15