硅膠柱層析分離純化TPGS的工藝*

常銀子，楊亦文，任其龍，張子安

1(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江臨安，311300)2(浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院，浙江杭州，310027)

硅膠柱層析分離純化TPGS的工藝*

常銀子1，楊亦文2，任其龍2，張子安1

1(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江臨安，311300)2(浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院，浙江杭州，310027)

采用硅膠層析法對自制的聚乙二醇1 000 VE琥珀酸酯(TPGS)進行分離純化，考察了柱溫、上樣量、上樣濃度和流量等因素對TPGS分離效果的影響，優(yōu)選出TPGS分離的工藝條件，并對其進行了驗證。結(jié)果表明:隨著柱溫、上樣量或流量的增加，TPGS分離純度和回收率均表現(xiàn)為“先增后降”趨勢;TPGS分離適宜工藝條件為40℃柱溫、4 g上樣量、0.3 g/mL上樣濃度和3mL/min流量，在此條件下，TPGS分離的平均純度和回收率可達93.13%和97.72%。

TPGS，水溶性VE，分離，硅膠柱

聚乙二醇1 000VE琥珀酸酯(TPGS)是由VE琥珀酸酯(VES)與聚乙二醇 (PEG)1 000酯化反應(yīng)生成的一種VE水溶性衍生物，結(jié)構(gòu)上含有VE親脂基團和聚乙二醇長鏈的親水基團，親水親油平衡值(HLB)約為13～17，具備表面活性劑的性質(zhì)和良好的水溶性［1］。TPGS為淡黃色的蠟狀固體，近乎無味，熔點約39℃，能穩(wěn)定存在于高溫(200℃以下)和空氣環(huán)境中［2］。鑒于TPGS的兩性特性(親水性與親脂性)、良好的水溶性以及熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，該物質(zhì)可作為增溶劑、乳化劑、吸收增強劑、可塑劑以及脂溶性藥物載體等的理想材料。目前，TPGS在國外已被廣泛應(yīng)用于制藥和營養(yǎng)品添加劑等領(lǐng)域［3］，但國內(nèi)對TPGS的研究甚少，主要集中于TPGS的制備和性能方面［4］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)［5］，TPGS 合成產(chǎn)物中存在一定量的VES，而VES和TPGS在極性上有很大差別，有必要對TPGS進行精制。本文采用硅膠柱層析法對自制的TPGS進行分離純化，考察其影響因素，進而運用正交試驗設(shè)計方法優(yōu)化出層析分離TPGS的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TPGS，實驗室自制;TPGS標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%)，美國Eastman公司;硅膠(粗孔硅膠Ⅱ號)100目，青島海洋化工廠;乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲醇、無水乙醇:均為分析純，中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司;常壓帶夾套層析柱(玻璃，φ20 mm×500 mm);RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;BS400S型電光分析天平，北京賽多利斯天平有限公司;DZF-6050型真空干燥箱:上海一恒科技有限公司;SC－15型數(shù)控超級恒溫箱，寧波天恒儀器廠;LC-10AT型高效液相色譜儀，717型Plus型自動進樣器，1525型泵，2487雙波長吸收檢測器(均為Waters公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 預(yù)試驗

通過梯度洗脫后，發(fā)現(xiàn)硅膠柱可以對TPGS實現(xiàn)提純，采用純?nèi)燃淄闀r，無法洗脫吸附在硅膠上的TPGS，溶劑V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2洗脫出來的基本上是前面合成反應(yīng)后過量的PEG，而用V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1 混合溶劑剛洗脫出來的產(chǎn)品，通過HPLC分析檢測，發(fā)現(xiàn)在292 nm波長范圍內(nèi)有2個峰，可能是VES琥珀酸單酯(VES)和聚乙二1 000VE琥珀酸雙酯，同時出現(xiàn)3個峰可能是VS、TPGS雙酯和TPGS單酯，并且VES的峰面積逐漸變小。后面出現(xiàn)1個峰可能是TPGS雙酯和單酯，只有1個峰的可能是TPGS單酯。由于目前尚未對TPGS雙酯和單酯進行研究，實驗中未把TPGS單酯和雙酯分離出，因此在之后的實驗分析中均以TPGS單酯和雙酯混合物的純度和回收率作為指標(biāo)，而以TPGS單酯和雙酯混合物作為產(chǎn)品。

1.2.2 單因素影響試驗程序

試驗選取純度和回收率作為TPGS分離純化效果的衡量指標(biāo)，依次考察柱溫、上樣量、上樣濃度和流量等分離條件對TPGS分離效果的影響［6－7］。

(1)裝柱:稱取50 g左右硅膠，150℃下活化2 h，濕法裝柱。

(2)上樣:取1～5.5 g已制備好的TPGS，用甲醇溶解，濃度控制在0.1～0.4 g/mL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 預(yù)試驗結(jié)果

(3)硅膠柱層析:以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脫，先后用 V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2、V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1、V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=7∶2依次以2～5mL/min的流量進行洗脫。每組梯度分別為550、600和450mL，直至無TPGS流出時停止。

(4)流分收集:每份50mL，旋蒸法蒸干，稱重，取樣，定容。V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2、V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1 處流分收集作為產(chǎn)品，并依次標(biāo)號。

(5)含量檢測:采用高效液相色譜法，雙波段檢測。分析方法按TPGS的合成工藝中檢測方法進行［7］。

(6)計算純度和收率:根據(jù)HPLC分析結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積坐標(biāo)，得到一直線，擬和得到擬和的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到回歸方程y=3×106－684 072，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。將待測產(chǎn)物的峰面積值相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)，得出相應(yīng)產(chǎn)物濃度［8～9］。

TPGS的純度(x)/%=n×100/m

TPGS的收率(y)/%=n* ×100/n

其中:m為1 050mL流分旋蒸蒸干后的質(zhì)量，g;n為原料中PEG的量，g;n*為分離后TPGS的量，g。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取對TPGS分離效果影響較大的因素進行多因素正交試驗(表1)。

表1 正交試驗所考察因素及其水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 柱溫對分離效果的影響

柱溫考察范圍為20～50℃。具體反應(yīng)條件為:上樣量4 g，上樣濃度為0.3 g/mL，流量3mL/min。柱溫對于分離的影響結(jié)果如圖3和表2所示。

圖3 不同柱溫的洗脫曲線

表2 柱溫對純度和回收率影響

由表2可以看出，柱溫對TPGS分離效果影響較大，當(dāng)柱溫由20℃升至40℃，純度和回收率均呈現(xiàn)增加趨勢。但進一步升高溫度至50℃，2個標(biāo)值明顯下降。圖3和表2均表明，在40℃柱溫條件下可分離出最大量的TPGS，且對TPGS單酯和雙酯分離效果最佳，此時純度和回收率分別高達92.97%和95.62%。因此以下試驗采用40℃柱溫進行TPGS分離。

2.1.2 上樣量對分離效果影響

控制40℃柱溫、3mL/min流量和0.3 g/mL的上樣濃度，考察上樣量在1～5.5 g內(nèi)對TPGS分離效果的影響，結(jié)果見圖4和表3。

表3 上樣量對TPGS的影響

從表3可以看出，上樣量對TPGS的分離也有較大影響，隨上樣量的增加，回收率也表現(xiàn)為“先增后降”的趨勢。上樣量為4.0 g時，回收率達到最大值(96.74%)。而純度在上樣量較小時變化不大，均在90% 以上，但當(dāng)上樣量增至5.5 g，純度下降明顯。圖4也同樣反映出高上樣量條件下TPGS的分離效果欠佳。原因可能是上樣量過高，超過了硅膠柱所能達到的吸附量，因而反應(yīng)后期難以分離出雜質(zhì)，導(dǎo)致TPGS洗脫效果下降。以下試驗上樣量控制在4 g。

圖4 不同上樣量的洗脫曲線

2.1.3 上樣濃度對分離效果的影響

上樣濃度可能會影響到硅膠柱的吸附效果，由此對分離效果產(chǎn)生一定影響。本試驗考察了上樣濃度于0.1～0.4 g/mL內(nèi)變化對分離效果的影響。試驗在柱溫為30℃、上樣量為4 g、流量為3mL/min的條件下進行，試驗結(jié)果見圖5和表4。

圖5 不同上樣濃度的洗脫曲線

表4 上樣濃度對TPGS的影響

從圖5和表4可以看出，上樣濃度較低時(0.1～0.3 g/mL)，TPGS純度較高且穩(wěn)定。但上樣濃度增至0.4 g/mL時，TPGS純度急劇下降。回收率受上樣濃度的影響相對小，當(dāng)上樣濃度為0.3 g/mL時，TPGS回收率最大，達到93.18%。以下試驗選擇0.3 g/mL上樣濃度。

2.1.4 流量對分離效果的影響

試驗控制柱溫為30℃，上樣量為4 g，上樣濃度為0.3 g/mL。調(diào)節(jié)流量由2mL/min梯度遞增至5mL/min，考察流量對分離效果的影響，結(jié)果見圖6和表5。從圖6和表5看出，隨著流量的增加，TPGS分離純度及其回收率為先增后降。流量增大TPGS的各項指標(biāo)都會減少，當(dāng)流量在4mL/min時，產(chǎn)品量為3.139 2 g，同時純度為90.59%，比低流量的TPGS量要低，之后純度、回收率都降到最低點。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是由于當(dāng)流量過大時，TPGS與硅膠的接觸時間要短，在這種情況下TPGS在硅膠柱上可能無法達到吸附平衡，導(dǎo)致TPGS伴隨洗脫劑的流出而流出，因此達不到分離的效果。但流量太少會導(dǎo)致分離過程太過漫長，耗費大量的人力物力，因此本實驗的流量選擇3mL/min。

圖6 不同流量的洗脫曲線

表5 流量對TPGS總的影響

2.2 分離條件的優(yōu)化

單因素試驗結(jié)果表明，柱溫、上樣量、上樣濃度和流量對TPGS的分離效果均產(chǎn)生一定影響。為優(yōu)化出硅膠柱層析分離TPGS的理想工藝條件，并區(qū)分出主次影響因素，本研究在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，借助不完全多因素試驗方法與理論，安排了4因素3水平的正交試驗，結(jié)果見圖7與表6。

對比表6中純度和回收率數(shù)值可知，2號(A1B2C2D2)和8號(A3B2C2D3)分離效果相對較好。而圖7顯示出在不同分離條件下的TPGS分理效果差異比較顯著，其中 2號(A1B2C2D2)和 5號(A2B2C3D1)分離效果具有明顯優(yōu)勢。

表6中k值為各因素在相應(yīng)水平下的試驗結(jié)果之和與水平數(shù)的比值，其值排除了其他因素的干擾，可反映該因素的水平效應(yīng)。比較表6中k值大小可以看出，若以純度為考察指標(biāo)，因素A(柱溫)對應(yīng)的k2與k3值相差很小，因而可取 A2－3B2C2D2為最大程度提高TPGS純度的理想工藝條件組合;而若以回收率為考察指標(biāo)，考慮到因素A對應(yīng)的各k值無明顯差別，而因素C(上樣濃度)對應(yīng)的k1與k2值相差甚微，故認(rèn)為A1-2-3B3C1-2D2組合為回收TPGS的較佳工藝條件。

圖7 不同分離條件組合的TPGS洗脫曲線

表6 TPGS分離正交試驗結(jié)果

R值可反映出相應(yīng)因素對試驗結(jié)果影響的顯著性。由表6可看出，各因素對純度指標(biāo)的影響主次順序為B＞C＞A＞D，對回收率指標(biāo)的影響主次順序為C＞B＞D＞A。

綜合考慮上述分析結(jié)果，衡權(quán)純度和回收率兩項指標(biāo)，并結(jié)合實際物耗與能耗等因素，可取A2B2C2D2組合(柱溫30℃、上樣量4 g、上樣濃度0.3 g以及流量3mL/min)為硅膠柱層析分離TPGS最佳工藝條件。

2.3 驗證試驗

按上述正交試驗最佳水平組合進行3次重復(fù)試驗，考察優(yōu)化結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，結(jié)果見表7所示。由表7可知，該最優(yōu)分離條件下，TPGS平均純度和回收率分別達到97.72%和93.13%。3次試驗結(jié)果差異較小，說明該工藝條件組合穩(wěn)定可靠。

表7 合成條件的驗證結(jié)果

3 結(jié)論與展望

(1)單因素試驗結(jié)果表明，各考察因素對分離效果均產(chǎn)生不同程度地影響。試驗條件下，隨著柱溫、上樣量或流量的增加，TPGS分離純度及其回收率均表現(xiàn)為“先增后降”的趨勢，表明TPGS分離過程中該三因素存在著最佳值。上樣濃度對兩項考察指標(biāo)影響規(guī)律各異。

(2)正交化化試驗結(jié)果表明，硅膠柱層析分離TPGS的最佳工藝條件為:柱溫30℃，上樣量4 g，上樣濃度0.3 g和流量3mL/min。各因素對純度指標(biāo)的影響主次順序為:上樣量 ＞上樣濃度 ＞柱溫 ＞流量，對回收率指標(biāo)的影響主次順序為:上樣濃度 ＞上樣量 ＞流量 ＞柱溫。

(3)驗證試驗結(jié)果表明，硅膠層析法分離純化TPGS具有較好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。在最佳工藝條件下，TPGS平均純度和回收率分別可達93.13%和97.72%。

預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)TPGS的產(chǎn)品非單一物質(zhì)，至少存在TPGS單酯和雙酯兩種成分，因此下一步擬開展TPGS單酯和雙酯分離條件的影響規(guī)律及其優(yōu)化等方面的研究。

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Separation and Purification of TPGS by Silica Gel Column Chromatography

Chang Yin-zi1，Yang Yi-Wen2，Ren Qi-long2，Zhang Zi-an1
1(College of and Food Food and Agriculture，Zhejiang Forestry University，Lin＇an 311300，China)2(College of Materials Science and Chem ical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

We purified the TPGS though Silica gel column chromatography.In order to improve separation conditions，chromatography temperature，load of sample，concentration of sample and flow rate factors were tested to see the influence to the separation.The optimal conditions of silica gel column chromatography were as follows:Chloroform，Petroleum ether and Acetic ether were used as mobile phases，the chromatography temperature is 40℃，the load of sample is 4g，the concentration of sample is 0.3g/mL，and the flow rate is 3ml/min.Finally the average purity is 93.13%，and the average yield is 97.72% .

TPGS，water-soluble vitamin E，separation，silica gel column chromatography

碩士，講師。

*2009年浙江省高等學(xué)校青年骨干教師國內(nèi)訪問學(xué)者項目

2010－04－03，改回日期:2010－06－25