卡托普利對博萊霉素致小鼠肺纖維化的防治作用及其機制探討

彭張哲，朱玉嫻，陶立堅，王 菱，寧旺斌

（1.中南大學湘雅醫院 腎內科，湖南 長沙 410078；2.中國人民解放軍第二軍醫大學長征醫院 腎內科，中國 上海 200003）

特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF）是一種以細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度合成和沉積為主要特征的、具有嚴重破壞性的肺部疾病。IPF導致正常肺結構的破壞，包括肺泡間隔增寬，功能性毛細支氣管腔塌陷，最終出現嚴重的肺功能不全，目前尚無切實有效的治療方法[1]。

在肺間質纖維化的病理過程中，局部血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）起到了非常重要的作用，該系統中的主要效應因子血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可以通過多種機制參與肺纖維化的發生和發展。如誘導肺泡上皮細胞凋亡，刺激肺成纖維細胞產生細胞外基質，刺激促纖維化細胞因子的釋放等[2～4]。因此，血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）或AngⅡ受體拮抗劑可能為肺纖維化的治療提供新的手段。

本研究首先通過尾靜脈分次小劑量注射博萊霉素建立穩定的肺間質纖維化模型。通過進一步觀察卡托普利對小鼠肺纖維化的保護作用，初步探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

博來霉素系日本化藥株式會社產品。卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司產品。蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司。CTGF抗體購自Abcam公司。β-actin單克隆抗體購自Sigma公司。ECL發光試劑盒購自Amersham Life Science公司（Little Chalfont，UK）。Trizol購自 Invitrogen公司，熒光實時定量PCR試劑盒購自日本TaRaKa公司。逆轉錄試劑盒購自Fermentas（MBI）公司。7900熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。圖像分析系統采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統（華中科技大學同濟醫學院清屏影像公司）。

1.2 實驗動物分組及處理

1.2.1 造模 45只清潔級ICR小鼠，雄性、7～10周齡、體重約28～39 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（許可證號：SCXL[滬]2003-0003），小鼠在動物實驗室內適應性飼養一周后，隨機分為三組：即正常對照組（15只）、卡托普利組（15只）和模型組（15只）。卡托普利組、模型組均給予尾注射10 mg/kg博來霉素持續14 d[5]。正常對照組按5mL/kg給予生理鹽水尾靜脈注射，持續14 d。

1.2.2 給藥方案正常對照組小鼠按5mg/（kg·d）給予0.5%CMCNa溶液灌胃；卡托普利組小鼠按12.5mg/（kg·d）給予卡托普利灌胃；模型組小鼠按5 mg/（kg·d）給予0.5%CMCNa溶液灌胃。所有灌胃給藥均從造模前1 d開始給予，持續28 d。

1.3 標本處理、形態學觀察及纖維化評分

各組小鼠均于造模開始后第28天處死，采用腹腔內注射10%水合氯（3.5～4.0）mL/kg深度麻醉法處死，留取血清及雙側肺臟。左側肺臟用4%甲醛固定、石蠟包埋、制成4μm厚切片，做HE染色及Masson染色。參照SZAPIEL[6]觀察肺泡炎（0～3分）和肺纖維化（0～3分）。

1.4 Western blot測定CTGF蛋白表達

取肺組織勻漿，蛋白定量后行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉后加入CTGF一抗（1︰1 000），4℃過夜后加入1︰10 000稀釋的二抗，室溫孵育60min，加入ECL液后于暗室中膠片顯影曝光。內參照為β-actin。對實驗結果進行掃描之后，采用Bio-Rad公司的圖形分析軟件Quantity One對特異性條帶進行灰度分析。以CTGF/β-actin的光密度值表示CTGF的相對表達量。

1.5 RNA抽提、cDNA合成與實時熒光定量PCR檢測

應用Trizol抽提小鼠肺臟中的總RNA，逆轉錄合成cDNA后再進行Real-time PCR反應。引物序列設計通過Primer3軟件完成，各目的基因引物如下：CollagenⅠ上游引物序列5'-CCCAGAGTGGAACAGC GATTAC-3'；下游引物序列5'-TGTCTTGCCCCATTC ATTTGTC-3'。CollagenⅢ上游引物序列：5'-CCTCAG GGTATCAAGGGTG-3'；下游引物序列5'-GATCCAG GGTTTCCATCC-3'。TGF-β1上游引物序列：5'-AG GCGGTGCTCGCTTTGT-3'；下游引物序列5'-TGTTG CGGTCCACCATTAGC-3'。CTGF上游引物序列5'-GTGTGTGACGAGCCCAAGGA-3'；下游引物序列5'-AGTTGGGTCTGGGCCAAATGT-3'。GAPDH 上游引物序列5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'；下游引物序列5'-TGTTGCGGTCCACCATTAGC-3'。反應條件為：①變性95℃ 10 s；②PCR反應95℃5s，60℃ 30 s，40個循環；③溶解曲線95℃ 15 s，60℃15 s，95℃ 15 s。最后根據ΔΔCt方法對樣品的mRNA含量進行定量分析[7]。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 大體形態觀察

正常對照組：雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組：雙肺呈灰白色，或蒼白色，表面有出血點和壞死灶，質地較硬，體積縮小。卡托普利組：部分肺葉暗紅色或灰白色，表面有出血點和壞死灶，部分肺葉表面光滑。

2.2 光鏡觀察

正常對照組未出現明顯病變，模型組大量炎性細胞浸潤，同時出現肺纖維化病變，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細胞、淋巴細胞所占據。卡托普利治療組可見肺泡間隔增厚程度稍減輕，炎性細胞較少，可見中量膠原纖維。卡托普利治療組的肺泡炎及肺纖維化程度較模型組有減輕的趨勢，但半定量評分結果無統計學意義（圖1，圖2，表1）。

圖1 三組小鼠肺組織病理改變（HE×100）

圖2 三組小鼠肺組織病理改變（Masson×100）

表1 三組小鼠肺組織肺泡炎、肺纖維化半定量評分結果（±s）

表1 三組小鼠肺組織肺泡炎、肺纖維化半定量評分結果（±s）

注：?與對照組比較，P＜0.01

組別 鼠數（只） 肺泡炎評分 肺纖維化評分對照組 15 1.22±0.44 0.33±0.52模型組 15 3.00±0.00? 3.00±0.00?卡托普利組 15 2.71±0.48? 2.33±0.82?

2.3 Real-time PCR檢測各組小鼠肺組織中CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA水平

Ⅰ型膠原：與正常組比較，造模后兩組的Ⅰ型膠原mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，卡托普利組能下降Ⅰ型膠原mRNA水平（P＜0.01）。Ⅲ型膠原：與正常組比較，造模后兩組的Ⅲ型膠原均顯著升高（P＜0.01）；卡托普利組的Ⅲ型膠原mRNA水平與模型組相比并無明顯差別（表2）。

表2 肺組織I、III型膠原m RNA水平比較（±s）

表2 肺組織I、III型膠原m RNA水平比較（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01

組別 鼠數（只） I型膠原mRNA III型膠原mRNA對照組51.08±0.08 1.23±0.37模型組53.51±0.161） 4.41±0.301）卡托普利組52.79±0.221）2） 4.30±0.201）

2.4 Real-time PCR檢測各組小鼠肺組織中TGFβ1、CTGF mRNA 的表達

相對于正常對照組，博萊霉素尾靜脈注射14 d后小鼠肺組織中TGF-β1表達增高4.86倍，CTGF的mRNA表達量在模型組小鼠肺組織中也增高了3.62倍。經過卡托普利治療28d之后，TGF-β1mRNA與CTGF mRNA表達量明顯降低（P＜0.01）（表3）。

2.5 Western-blot檢測CTGF蛋白表達

Western-blot檢測結果顯示：相對于正常對照組，模型組小鼠肺組織中CTGF蛋白表達顯著增高（P＜0.01），經過卡托普利治療28 d之后，小鼠肺組織 CTGF的表達明顯下調（P＜0.01）（圖 3）。

圖3 各組小鼠CTGF蛋白表達

表3 肺組織TGFβ1、CTGF m RNA表達水平比較（±s）

表3 肺組織TGFβ1、CTGF m RNA表達水平比較（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01

組別 鼠數（只） TGFβ1 mRNA CTGF mRNA對照組51.21±0.26 1.31±0.37模型組54.86±0.341） 3.62±0.421）卡托普利組52.95±0.621）2） 2.88±0.411）2）

3 討論

博萊霉素是一種細胞毒性藥物，具有致肺纖維化的作用，是目前應用最為廣泛的建立肺纖維化動物模型的方法。目前，在國內用博萊霉素復制肺纖維化動物模型，多應用氣管內滴入法。該造模方法需要進行暴露氣管的手術，方法比較繁瑣，且有一定感染的危險性。該方法形成的組織病理改變主要集中在細支氣管的周圍，不符合IPF的病理變化[8]，不利于觀察藥物療效。本文參考國外文獻[5]，通過尾靜脈多次注射小劑量博萊霉素的方法形成了廣泛而穩定的肺間質纖維化改變，這些病理改變主要分布于胸膜下及血管周圍，這與IPF的病理變化相似，并且該方法操作簡單，減少了感染及氣管切開帶來的手術風險。本文的研究顯示，通過尾靜脈注射博萊霉素的造模方法在一定程度上優于氣管內給藥的方法。

Ⅰ型和Ⅲ型膠原構成肺組織基質的主要成分，其中Ⅰ型膠原的含量最為豐富，主要見于支氣管樹和血管樹的周圍即肺泡周間質，僅有少量的散布于肺泡間質內。Ⅲ型膠原則主要見于肺泡間質內，包括肺泡壁、小葉間隔，構成了肺間質的主要膠原成分。在肺間質纖維化的早期，主要以Ⅲ型膠原的增多為主，慢性及終末期則以Ⅰ型膠原增長為主[9，10]。本文的試驗結果顯示：14 d博萊霉素所致小鼠肺纖維化模型Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平都顯著增高，但Ⅲ型膠原mRNA水平較一型膠原mRNA增高更為明顯。結合對肺組織病理切片的觀察我們認為：14 d博萊霉素尾靜脈注射小鼠肺纖維化模型的肺部病變仍屬肺間質纖維化的早中期，以Ⅲ型膠原的增多為主。本文進一步證實卡托普利能夠顯著降低肺纖維化組織中升高的Ⅰ型膠原mRNA水平，而對Ⅲ型膠原mRNA水平無明顯影響。本文同時發現，卡托普利治療組對于模型組有減輕肺間質纖維化的趨勢，但無統計學意義，這可能與卡托普利只降低了Ⅰ型膠原的mRNA水平而對Ⅲ型膠原mRNA水平無明顯影響相關。這可能提示卡托普利對早中期的肺間質纖維化程度影響不大，而當纖維化進入晚期以Ⅰ型膠原沉積為主時，才能夠通過干擾膠原合成起到抗肺間質纖維化的作用。

有國外文獻報道，血管緊張素轉化酶抑制劑卡托普利能通過抑制肺泡上皮細胞凋亡抗肺間質纖維化[11，12]。另有學者也證明，卡托普利抗放射性肺纖維化的機制與下調轉化生長因子 1（TGF-β1）、α-SMA水平有關[13]。TGFβ1是組織生長、修復炎癥的重要細胞因子，TGFβ1的激活和異常表達總是伴隨著肺實質的病變，包括肺間質纖維化以及其它的氣道疾病。在博萊霉素導致肺纖維化的模型中，總是能觀察到TGFβ1的過度表達、活化以及其下游的信號傳導途徑激活[14～17]。用各種方式阻斷或下調TGFβ1的過度表達，能夠明顯緩解肺間質纖維化的發生、發展[18，19]。結締組織生長因子（CTGF）是目前得到公認TGF-β1的下游效應介質，與TGF-β1一起參與了眾多組織的細胞增殖及ECM的合成。CTGF主要介導 TGF-β1的促纖維化效應，而TGF-β1的其它效應卻不由CTGF介導，所以CTGF的生物學行為更為專一，具有更強的靶向性[20～23]。本文的研究顯示，卡托普利不但能夠降低肺纖維化組織中TGFβ1的mRNA水平，還能同時降低其下游的CTGF的mRNA和蛋白表達。這說明抑制激活的TGFβ1/CTGF通路是卡托普利抑制Ⅰ型膠原mRNA表達，進而實現抗肺間質纖維化的重要機制之一。

4 致謝

（本實驗均在醫學遺傳學國家重點實驗室完成，真摯感謝醫學遺傳學國家重點實驗室提供的技術支持以及儀器設備等硬件支持）。

[1]CRYSTAL RG,BITTERMAN PB,MOSSMAN B,et al.Future research directions in idiopathic pulmonary fibrosis:summary of a national heart,lung,and blood institute working group[J]. Am J Respir Crit Care Med,2002,166:236-246.

[2]WANG R,ZAGARIYA A.AngiotensinⅡinduces apoptosis in human and rat alveolar epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,1999,276:L885-L889.

[3]MARSHALL RP,GOHLKE P,CHAMBERS RC,et al.AngiotensinⅡand the fibroproliferative response to acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,286(1):L156-164.

[4]WANG R,ZAGARIYA A,ANG E,et al.Fas-induced apoptosis of alveolar epithelial cells requires ANGⅡgeneration and receptor interaction[J].Am J Physiol,1999,277 (6 Pt 1):L1245-1250.

[5]T.KAKUGAWA,H.MUKAE,T.HAYASHI,et al.Pirfenidone attenuates expression of HSP47 in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Eur Respir J,2004,24:57-65.

[6]SZAPIEL SV,ELSON NA,FULMER TD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the Nude,Athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120:893-899.

[7]WINER J,JUNG CK,SHACKEL I,et al.Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase?polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro[J].Anal Biochem,1999,270:41-49.

[8]CHUA F,GAULDIE J,LAURENT GJ,et al.Pulmonary fibrosis:searching for model answers[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(1):9-13.

[9]GERRIETS JE,REISER KM,LAST JA.Lung collagen cross-links in rats with experimentally induced pulmonary fibrosis[J].Biochim Biophys Acta,1996,1316(2):121-131.

[10]ZHANG K,REKHTER MD,GORDON D,et al.Myofibroblast and their role in lung collangen gene expression during pulmonary fibrosis;a combined immunohistochemical and insituhybridization study[J].Am J Pathol,1994,145(2):114-125.

[11]WANG R,IBARRA-SUNGA O,VERLINSKI L,et al.Abrogation of bleomycin-induced epithelial apoptosis and lung fibrosis by captopril or by a caspase inhibitor[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000,279(1):L143-151.

[12]CANDAN F,ALAGOZLU H.Captopril inhibits the pulmonary toxicity of paraquat in rats[J].Hum Exp Toxicol,2001,20(12):637-641.

[13]MOLTENI A,WOLFE LF,WARD WF,et al.Effect of an angiotensinⅡreceptor blocker and two angiotensin converting enzyme inhibitors on transforming growth factor-beta(TGF-beta)and alpha-actomyosin(alpha SMA),important mediators of radiation-induced pneumopathy and lung fibrosis[J].Curr Pharm Des,2007,13(13):1307-1316.

[14]KHALIL N,PAREKH TV O'CONNOR RN,GOLD L et al.Differential expression of tansforming growth factor-β type ⅠandⅡreceptors by pulmonary cells in bleomycin-induced lung injury:correlation with repair and fibrosis[J].Exp Lung Res,2002,28:233-250.

[15]ZHAO J,SHIW,WANG YL,et al.Smad3 deficiency attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282:L585-L593.

[16]GAULDIE J.Pro-inflammatory mechanisms are a minor component of the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165:1205-1206.

[17]KEANE MP,STRIETER RM.The importance of balanced pro-inflammatory and anti-inflammatory mechanisms in diffuse lung disease[J].Respir Res,2002,3:5.

[18]GAULDIE.TGFβand Smad3 link inflammation to regressive fibrosis[J].International Congress Series,2007,1302:103-113.

[19]BONNIAUD P,MARTIN G,MARGETTS PJ,et al.CTGF is crucial to induce a profibrotic environment in‘fibrosis resistant alb/c mouse lungs’[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2004,31(5):510-516.

[20]XU YD,HUA J.Release of biologically active TGF-β1 by alveolar epithelial cells results in pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,285:L527-539.

[21]DUNCAN MR,FRAZIER KS,ABRAMSON S,et al.Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor beta-induced collagen synthesis:down-regulation by cAMP[J].FASEB J,1999,13:1774-1786.

[22]HISIKAWA K,NAKAKI T,FUJII T,et al.Transforming growth factor-beta1 induces apoptosis via connective tissue growth factor in human aortic smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol,1999,385:287-290.

[23]M.M.CHEN,A.LAM,J.A.ABRAHAM,et al.CTGF Expression is induced by TGF-βin cardiac fibroblasts and cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2000,32:1805-1819.