甘草甜素對HepG2.2.15細胞株HBeAg水平及TLR4表達的影響*

李永偉，楊宏志，郭云蔚，陸慧瓊，凌小強

（中山大學附屬第三醫院 1中醫科，2消化內科，3中心實驗室，4感染病科，廣東 廣州 510630）

甘草類制劑如甘利欣、復方甘草甜素（olycyrrhizin，GL）可影響 HBV 復制或抗原分泌[1～3]，甘草甜素是中藥甘草中的主要有效成分。基礎和臨床研究表明，GL具有抗炎、抗纖維化、降酶、退黃及免疫調節等作用，被廣泛用于治療各種急慢性肝炎。某些研究者認為，GL可誘生干擾素抑制HBV[1，2]。目前在體外實驗發現，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是激活后產生干擾素的重要信號分子，可促進抗病毒的細胞免疫，具有抑制病毒復制的作用[3]。本實驗研究了GL體外對HBeAg的作用及對TLR4信號分子的影響，以了解該藥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養基（GIBCO公司），G418和MTT（Sigma公司），胎牛血清（ GBico公司），96孔、6孔培養板及25 cm2培養瓶（COSTER公司），酶標儀（BIO-RAD、Model 450 MICRoPLATE READER），ELISA試劑盒購自中山生物公司，Real-time PCR檢測試劑盒購自中山大學達安基因公司，甘草甜素GL（商品名：美能）由日本美能生源制藥公司生產，TLR4抗體購自eBioscience公司，HepG2.2.15細胞株由本實驗室保存。其他試劑來自于廣東省肝臟疾病研究重點實驗室。

1.2 實驗分組及藥物濃度設定

將GL按原藥物濃度用DMEM倍比稀釋成5個濃度梯度：800、400、200、100、50μg/mL；并設空白對照組。

1.3 細胞培養

將HepG2.2.15細胞鋪于六孔板，接種于DMEM混合培養液（含1O%胎牛血清、G418 200μg/mL），置5%二氧化碳培養箱中37℃培養，每3天換液一次，每孔加培養液至2mL，第5、6天加入相應劑量GL，共2次。 第7天收集細胞行流式細胞儀檢測，每劑量組3個復孔，分3次獨立實驗完成。

1.4 細胞存活率測定

藥物細胞毒性實驗系通過MTT法測定細胞存活率。細胞接種于96孔板，接種第5，6天給藥，第7天加入1mg/mL MTT液每孔20μL，于5%二氧化碳培養箱中37℃培養4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 200μL。細胞存活率%=實驗孔OD值/對照孔OD值×100%。

1.5 檢測細胞培養上清中HBeAg水平

取收集的上清液，用ELISA法檢測，按試劑盒說明書操作，含量直接用OD值表示。

1.6 直接免疫熒光流式細胞術檢測TLR4表達

給藥后第7天收集細胞，加DMEM培養基1 000 r/min 離心 3～5min，去掉培養基，500μL PBS重懸細胞，取100μL細胞懸液，分別加TLR4標記抗體各 10μL，混勻，避光孵育 20～30min，加 PBS 2 mL，2 000 r/min離心 5min，棄上清，加 1mL PBS 重懸上機，同型對照加無關抗體消去本底。

1.7 熒光定量PCR檢測TLR4 m RNA的表達

培養至第七天收集細胞并提取總RNA（Qiagen RNeasy Mini Kit，Gene copmpany），逆轉錄為第一鏈cDNA（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，#K1621，Fermatas），兩步法定量PCR（SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit TaKaRa，DRR041S，寶生物工程（大連有限公司））檢測TLR4的表達水平。β-actin：正向引物：TGGCACCCAGCA CAATGAA,反向引物：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；TLR4正向引物:TCAGGTCCAGGTTCTTG GTTGAG,反向引物:AGGATGATGCCAGGATGATGTC。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 GL對HepG2.2.15細胞增殖活性的影響

結果顯示，細胞增殖活性隨GL量的增加，由促進增殖而變為抑制增殖，即較小劑量促進細胞生長。其中，50μg/mL組與對照組比較差異有統計學意義，P＜0.05；200μg/mL 以下三組間差異不顯著，P＞0.05；400μg/mL以上劑量則開始變為抑制細胞增殖，400μg/mL與800μg/mL分別與其它各組比較差異有顯著性，P＜0.01。尤其是800μg/mL更為明顯，存活率只有20.7%。見表1。本結果與文獻報道一致[1]。

2.2 不同劑量GL干預后細胞培養上清HBeAg的表達

HBeAg的表達結果顯示，GL各劑量組給藥后第7天總體均數間差異顯著，有統計學意義（P＜0.05）；200μg組以下雖然降低，但與對照組比較無顯著差異；400μg以上組HBeAg升高，但與對照組比較無顯著差異；800μg/mL組較 100、200μg/mL組明顯升高，差異有統計學意義，P＜0.05。見表1。

2.3 GL治療各組及對照組TLR4陽性細胞率的表達

治療后48 h流式細胞儀檢測TLR4陽性細胞率的表達，各組表達TLR4的陽性細胞率總體均數間差別有統計學意義。各劑量組與對照組比較，顯示表達TLR4的陽性細胞率均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01），尤其100μg/mL組最明顯，與其他各組相比差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.4 GL治療各組及對照組TLR4mRNA的表達

治療后RT-PCR檢測TLR4 mRNA的表達，各組表達TLR4水平總體均數間差別有統計學意義。各劑量組與對照組比較顯示TLR4水平均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01），尤其100μg/mL組最明顯，與其他各組相比差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 GL對HepG2細胞的影響

2.5 GL干預后各指標的相關性

GL干預后，MTT結果與HBeAg呈顯著負相關（r=-0.584,Sig=0.003）；TLR4 mRNA 與 TLR4 流式結果呈顯著正相關（r=0.881，Sig=0.000）。TLR4 mRNA及TLR4流式結果分別與MTT、HBeAg比較無相關關系（P＞0.05）。

3 討論

TLR為I型跨膜蛋白，是連接先天和后天免疫的關鍵信號分子。TLR參與機體免疫反應，可促進細胞因子的合成與釋放、促使免疫細胞成熟、分化，調節適度水平的免疫應答，因而可起到抗病毒的作用[4]，但也引起肝臟損傷。近來的研究顯示，TLR信號系統可能在肝臟疾病包括丙型病毒（HCV）性肝炎的發生及免疫介導的肝細胞損傷中起重要作用。其中，HCV的蛋白成分可直接調節TLR家族的信號分子，是HCV持續感染的機理之一[5]。HBV的核心抗原可促使人類的THP-1巨噬細胞分泌細胞因子，這一作用依賴于TLR2介導的核轉錄因子的激活[6]。體內外實驗發現，HBeAg可下調TLR2的表達[7，8]。但TLR2與其配體在乙肝轉基因小鼠沒有抗病毒作用，而TLR4與其配體則可有效抑制病毒[3]。在免疫低下的慢乙肝患者，可出現肝細胞TLR的表達并直接導致肝損傷，提示TLR信號途徑激活產生IFN的同時，也可能激活了炎癥因子導致肝細胞的病理性損害[9]。我們既往研究發現，在HBV持續感染的HepG 2.2.15細胞株TLR2、TLR4表達降低，表明HBV慢性感染可能需要TLR的低表達以逃避免疫清除，而GL可上調TLR水平，以100μg/m L組最為顯著，但200μg/m L組作用較其它組弱[10]；本研究與既往研究不同的是200μg/m L組對TLR4的調節仍較強，可能與兩次研究所用細胞株不同有關，此次為HBV野生型的細胞株。

在臨床病例中發現，慢乙肝輕度患者血清IL-2、IFNγ基本正常,但隨著炎癥的加重逐漸減少,慢性重型肝患者濃度則最低，上述Th1類細胞因子的低表達是病毒不能清除的原因之一[11]。有人認為，GL抗病毒的機理可能與誘生干擾素有關 ，干擾素產生的重要途徑為TLR信號家族途徑，GL有可能通過影響TLR信號分子的表達來促進干擾素產生。李金興研究了GL對單個核細胞的影響，其產生干擾素的最適劑量為100μg/mL12]。我們兩次結果均提示100μg/mL組表達TLR2、TLR4的陽性細胞數最多[10]，可能與干擾素的產生有一定關系。

GL對TLR4的上調可能有助于打破慢乙肝的免疫耐受狀態，通過調節先天免疫而激活抗病毒效應。MATTEO認為，在缺乏適應性免疫的情況下，先天免疫如TLR信號家族并不能顯著的導致肝臟損傷及病毒清除[13]，與GL體外非免疫細胞介導抑制Alexander細胞表面抗原[14]不同的是，如GL在體內激活免疫細胞的TLR，可進一步誘導特異性的細胞免疫，從而促進HBV清除，并且因GL具有抗炎作用，在抑制HBV的同時如何減輕TLR導致的病理損傷，需要進一步研究其作用機理及其中的復雜關系。

本文還研究了GL對HepG2.2.15細胞株抗原分泌的作用，發現GL既可能抑制、也可能促進e抗原分泌，即對HBV的抗原分泌具有雙向作用，但差異無統計學意義。本實驗還研究了GL對細胞增殖的影響，我們采用最后兩天持續給藥的方法，發現GL對細胞株增殖的影響與文獻其它給藥方法產生的結果類似，表現為中小劑量促進增殖，大劑量抑制細胞增長[1]，其機理需要深入研究。

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