大豆皂苷A和B對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孫 權(quán) 李 天 許惠仙 全吉淑

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,延吉 133000)

大豆皂苷A和B對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孫 權(quán) 李 天 許惠仙 全吉淑

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,延吉 133000)

采用 C18反相柱層析法從大豆胚軸提取大豆皂苷,研究其抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。采用MTT比色法觀察大豆皂苷對結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞增殖的影響,采用 TUNEL染色法檢測其對 HT-29細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,大豆皂苷呈時間和濃度依賴性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大豆皂苷可通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

大豆 皂苷 結(jié)腸癌 凋亡

流行病學(xué)調(diào)查證實(shí),常食大豆對預(yù)防癌癥和心血管疾病、增進(jìn)人體健康有益。這些功效均與大豆中的異黃酮和皂苷等生物活性物質(zhì)密切相關(guān)。大豆皂苷是存在于大豆中的一類五環(huán)三萜的糖苷,主要分為A類、B類、E類和DDMP皂苷,其中A類為雙糖鏈皂苷,B類、E類和 DDMP皂苷為單糖鏈皂苷。已有很多研究表明,大豆皂苷具有多種藥理作用,如抗癌、防治心血管疾病、抗病毒及保肝等作用[1-5],其中皂苷的抗癌作用尤其引起人們的關(guān)注。已證實(shí)大豆皂苷可抑制 S180、YAC-1和 P815細(xì)胞的DNA合成,并對人紅白血病細(xì)胞系 K562及 YAC-1細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用[6-7]。也有文獻(xiàn)報導(dǎo)大豆皂苷具有抗結(jié)腸癌作用,其抗癌作用可能是通過直接細(xì)胞毒作用和生長抑制作用[8]、抑制免疫活性[9-10]和誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬[11]。本試驗(yàn)以從大豆胚軸提取的大豆皂苷為原料,研究大豆皂苷對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

HT-29細(xì)胞:南京凱基生物技術(shù)公司。

1.2 藥物和試劑

大豆:中國東北產(chǎn)大豆;噻唑蘭:美國 Sigma公司; DME M培養(yǎng)基:美國 GI BCO公司;小牛血清:北京華美生物工程公司;胰蛋白酶美國D IFCO公司;細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒:北京中金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

H ITACH IU-2010型紫外分光光度儀、H ITA2 CH I高效液相色譜系統(tǒng):日本日立公司;OLY MPUS倒置顯微鏡:日本奧林巴斯公司;RT-2100型酶標(biāo)儀:深圳雷杜公司;YPS2000真彩色病理圖像分析儀:上海華巖儀器設(shè)備有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大豆皂苷的提取及水解

將大豆胚軸研磨粉碎,用 50%甲醇加熱提取,提取液經(jīng)噴霧干燥得粗粉。將粗粉用等體積正丁醇 -水溶液萃取,取正丁醇層,經(jīng)減壓蒸餾、冷凍干燥,得富含大豆異黃酮和皂苷的總糖甙試樣。將總糖苷用30%甲醇溶解,上 C18層析柱 (Y MC,ODS-A60-S150,5 cm×74 cm),依次用 30%、50%和 80%甲醇梯度洗脫,收集富含大豆皂苷的 50%和 80%甲醇流出部分。經(jīng)減壓蒸餾、冷凍干燥得干粉,分別稱為F50和 F80。

大豆皂苷的分析采用薄層色普法(MERCK,Kie2 selgel 60 F254)和高效液相色普法 (Y MC,ODS-AM -303,4.6mm×250mm,5μm)[12]。

1.4.2 MTT比色

結(jié)腸癌細(xì)胞貼壁生長,培養(yǎng)于含 10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置 37℃、相對濕度 90%、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞按每孔 1×105個細(xì)胞接種于 96孔板中,每孔體積200μL。待細(xì)胞貼壁后,藥物組加入藥物使其終質(zhì)量濃度分別為 40、80和 160 mg/L,另設(shè)不加藥物的陰性對照組以及不接種細(xì)胞的空白對照組。分別培養(yǎng) 24、48和 72 h,每個濃度每個時點(diǎn)均設(shè) 4個復(fù)孔。于終止前 4 h,每孔加入 5 g/L MTT溶液 20μL,繼續(xù)孵育 4 h后棄去上清液,加入 150μL DMSO,輕輕振蕩 10 min,使結(jié)晶物完全溶解,于490 nm波長處在酶聯(lián)分析儀上測光吸收值(A值),計(jì)算生長抑制率。

抑制率 =(對照組A值 -實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值 ×100%

1.4.3 HT-29細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期 HT-29細(xì)胞按 1×105個/瓶接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h后換液,加入含 160 mg/L藥物的10%新生小牛血清DME M培養(yǎng)液 200μL,另設(shè)不加藥物的陰性對照組。置5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.4.4 TUNEL染色

取經(jīng) 160 mg/L大豆皂苷作用 72 h的細(xì)胞爬片,按試劑盒操作說明進(jìn)行處理,光鏡下觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)。染色后細(xì)胞核呈棕褐色的細(xì)胞被判為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取 5個高倍鏡視野,分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù)(A I)。

A I=(凋亡細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆皂苷的提取結(jié)果

大豆胚軸提取粉用正丁醇萃取,得到總糖苷粗品,含大豆異黃酮 19.4%和皂苷 58.1%。總糖苷用30%甲醇充分溶解后上 C18層析柱,依次用 30%、50%和 80%甲醇梯度洗脫,可按極性大小將大豆異黃酮、A類皂苷與B類皂苷分開,使其依次分別分布在 F30、F50和 F80中 (表 1)。試樣 F30為較純的異黃酮樣品,其異黃酮主要形式為丙二酰化糖苷;F50含A類雙糖鏈皂苷 80.1%,另含少量異黃酮糖苷;F80含 B類單糖鏈皂苷 72.7%,與常溫提取相比,F80中DDMP皂苷明顯減少。這可能與DDMP結(jié)構(gòu)的加熱降解有關(guān),DDMP皂苷是天然存在的大豆皂苷形式,加熱提取使DDMP皂苷中的DDMP結(jié)構(gòu)以麥芽醇形式水解脫離,剩余部分轉(zhuǎn)化為B類皂苷。

表1 C18柱層析分離大豆總糖甙結(jié)果

2.2 對 HT-29細(xì)胞增殖的影響

不同質(zhì)量濃度皂苷處理組分別培養(yǎng) 24、48和72 h時,大豆皂苷 A和 B對 HT-29細(xì)胞生長均有抑制作用(P<0.01,表 2)。二者對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率呈時間和濃度依賴性,隨著時間的延長和濃度的增加,抑制效果更明顯。但二者對結(jié)腸癌細(xì)胞增值的抑制率卻無明顯差異 (P>0.05,表 2),且非常接近于大豆總皂苷提取物的抑制效果。

表 2 大豆皂苷對 HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)

表 2 大豆皂苷對 HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)

注:同一時間時與前一劑量相比,3表示 P<0.01;同一濃度時與前一時間相比,Δ表示 P<0.01

抑制率/%劑量/mg/L〗組別 主要成分24 h 48 h 72 h F50A類皂苷 40 9.3±0.4 17.2±1.1Δ18.7±1.2 80 17.7±1.8322.4±1.73Δ25.5±1.23160 22.9±1.4327.5±1.0340.7±1.33ΔF80B類皂苷 40 7.9±1.4 13.8±0.9Δ17.4±1.4 80 14.8±1.5320.1±1.03Δ24.0±1.53160 21.7±1.1324.1±1.1331.9±1.23

2.3 HT-29細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

圖 1為對照組和大豆皂苷 A處理組的 HT-29細(xì)胞光鏡照片。倒置顯微鏡觀察顯示對照組 HT-29細(xì)胞生長旺盛,折光率高,胞體大。大豆皂苷A和B處理組則均表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減慢,折光率減弱,變小浮起,部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中,但細(xì)胞膜完整。大豆皂苷組作用時間越長,上述表現(xiàn)越明顯。

圖1 HT-29細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

2.4 對 HT-29細(xì)胞凋亡的影響

用大豆皂苷處理細(xì)胞 72 h后,細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加,棕褐色染色顆粒定位于細(xì)胞核內(nèi)。大豆皂苷組凋亡指數(shù)與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表 3)。

表 3 大豆皂苷對 HT-29細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表 3 大豆皂苷對 HT-29細(xì)胞凋亡的影響(±s)

注:與前一時間相比,3表示 P<0.01

組別 主要成分 凋亡指數(shù)/% 24 h 48 h 72 h F50A類皂苷 4.7±1.5 10.7±0.7312.9±1.0 F80B類皂苷 5.4±1.7 9.4±0.8314.2±0.93

3 討論與結(jié)論

在大豆胚軸中異黃酮和皂苷主要以糖苷形式存在,只有極少量異黃酮以游離苷元形式存在。利用大豆異黃酮皂苷的此組成特點(diǎn),首先采用 C18反相柱層析法分離大豆胚軸中異黃酮糖苷和 A類、B類皂苷。抽提總皂苷時采用加熱提取方法,與常溫提取相比,加熱法提取的分級產(chǎn)物中 B類皂苷含量大大增高,而DDMP皂苷明顯減少。這可能與DDMP皂苷的加熱降解有關(guān)。DDMP皂苷是天然存在的真正大豆皂苷,加熱提取使DDMP皂苷中的DDMP結(jié)構(gòu)以麥芽醇形式水解脫離,剩余部分轉(zhuǎn)化為 B類皂苷。

細(xì)胞凋亡普遍存在于大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞中,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關(guān)系[13]。大多數(shù)抗腫瘤藥物都能誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且其抗腫瘤效能與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的活性有關(guān)。因此,誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的一個新熱點(diǎn),評價療效的一項(xiàng)新指標(biāo)[14]。本試驗(yàn)中MTT結(jié)果顯示大豆皂苷 A和 B均對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。其細(xì)胞生長抑制隨著藥物濃度的升高和時間的延長而增加,具有量效和時效關(guān)系。倒置顯微鏡觀察及TUNEL檢測結(jié)果說明,大豆皂苷 A和 B均可誘導(dǎo)結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞凋亡,這可能是大豆皂苷抑制結(jié)腸癌作用的機(jī)制之一。試驗(yàn)結(jié)果還顯示,在本試驗(yàn)所用濃度范圍內(nèi),大豆皂苷A和B對結(jié)腸癌細(xì)胞增值的抑制作用不顯示明顯差異。不同結(jié)構(gòu)大豆皂苷的抗結(jié)腸癌作用與其皂醇及糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)系需進(jìn)一步的研究。

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Effect of Soya Saponin A and B on Proliferation and Apoptosis of Colon Carcinoma Cell

Sun Quan Li Tian Xu Huixian Quan Jishu
(Medical College Yanbian University,Yanji 133000)

Soya saponins were isolated from soybean hypocotyl with C18 reversed phase column chromatogra2 phy,then their effect on proliferation and apoptosis of colon carcinoma cellwas investigated.MTT assaywas used to examine the proliferation of HT-29 cell,and TUNEL method was used for analysis of cell apoptosis.Results:Soya saponins inhibit the proliferation and induce the apoptosis of colon carcinoma cells in a time-and concentrationdependentmanner.It is suggested that soya saponins could exert an anti-colon cancer effect via inducement of ap2 optosis.

soybean,saponins,colon cancer,apoptosis

TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)03-0026-04

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃(200705428)

2009-04-02

孫權(quán),男,1959年出生,高級實(shí)驗(yàn)師,生物化學(xué)與分子生物學(xué)

全吉淑,女,1968年出生,副教授,分子腫瘤學(xué)