堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究

嚴梅榮 王丹丹 鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室,南京 210003)

堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究

嚴梅榮 王丹丹 鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室,南京 210003)

研究堿性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取菜籽多肽,試驗反應時添加亞硫酸鈉的影響及使用膜分離技術去除產物中的硫代葡萄糖苷。結果表明,Na2SO3通過對蛋白質分子中的二硫鍵的斷裂作用及對堿性蛋白酶抑制劑的影響,可提高堿性蛋白酶的活性,使得到的菜籽多肽的分子質量分布發生變化,小分子的多肽比例相應增加。結果同時顯示,膜分離可有效減少或除去硫代葡萄糖苷等抗營養因子,使用截留分子質量 3000 u的膜對菜籽粕酶解產物進行超濾和透析過濾,當超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數均為 2時,產物的硫代葡萄糖苷質量比從 1.36 mg/g降低到 0.39 mg/g。

菜籽 亞硫酸鈉 蛋白質水解 水解度

隨著世界人口增長和食物來源減少促使人們研究開發新的植物蛋白資源,其中對于油籽食用蛋白的開發已引起人們越來越大的興趣。菜籽是重要油料作物,世界年產量已超過 4 000萬噸,中國、印度和加拿大是主要生產國。菜籽提油后的粕中含有 40%～50%的蛋白,且菜籽蛋白氨基酸組成平衡,符合FAO要求,因此菜籽粕可能成為食用蛋白的合適來源[1-2]。由于菜籽粕中還存在硫代葡萄糖苷,植酸和多酚類等有毒和抗營養因子,因此目前主要還是當作飼料或肥料使用,只有盡量降低或除去這些有毒和抗營養物質,才有可能使菜籽粕作為食用蛋白來源。

近年來,蛋白水解物被認為是生物活性肽的來源,它們易于被大腸細胞吸收進入血液,產生有益的生物活性。已報道的生物活性肽具有免疫調節、抗菌、抗血栓形成和降血壓等生理功能,它們在食品、藥物和化妝品工業上的應用已引起人們廣泛的興趣。由于消費者對于動物蛋白的擔憂日益增加,因而更偏愛開發植物多肽。

酶水解蛋白是目前制取植物多肽的最重要手段,通過水解可以得到分子質量大小不同的肽。傳統的制取多肽方法是先通過堿提取酸沉淀法制取分離蛋白,再使用不同的蛋白酶將分離蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分復雜,難溶于水,通常需要使用 pH 11以上的強堿提取,加之菜籽蛋白等電點范圍廣,提取后加酸調節等電點析出的分離蛋白得率較低。本試驗使用堿性蛋白酶 Alcalase直接水解菜籽粕制取肽,利用膜分離除去硫苷等有毒物質,同時研究水解時加入低濃度亞硫酸鈉對于反應速率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

加拿大菜籽:張家港出入境檢驗檢疫局提供;堿性蛋白酶 Alcalase 2.4 L(活力 2.4 AU/g):諾維信公司;芥子酶 (>100units/g):Sigma公司。

1.2 試劑及儀器

石油醚 (30～60℃)、檸檬酸、二氯甲烷、氨水、亞硫酸鈉等:均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

JLGJ45檢驗礱谷機:浙江黃巖糧儀廠;LXJ-Ⅱ離心沉淀機:上海醫用儀器廠;SHA-C恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司;旋渦混合儀:上海滬西分析儀器廠;L-117實驗室噴霧干燥機:京來亨科貿有限責任公司;AKTAPpurifier蛋白純化儀:GE Healthcare Bio-Science AB公司;752紫外可見分光光度計:上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽脫殼

菜籽在礱谷機中碾壓后風揚去掉皮層,粉碎,待提取油脂。

1.3.2 菜籽脫油

使用自制索氏提油裝置提取菜籽油脂,該裝置結構和原理與市售測定含油量用索氏抽提器相同,但進行了放大,每次提油的脫殼菜籽量為 250 g。使用石油醚經 12 h抽提脫去油脂,室溫晾干除去溶劑得到菜籽粕,粉碎過 80目篩后備用。

1.3.3 菜籽粕的主要組分測定

水分含量的測定采用 GB5497—1985(105℃恒重法);含油量的測定采用 GB5512—1985;蛋白質含量的測定采用 GB5511—1985;灰分含量的測定采用GB5505—1985。

1.3.4 硫代葡萄糖苷的測定方法

按Watter等[3]的方法測定。稱取樣品 0.1 g于10 mL磨口試管中,加入 3 mg芥子酶,1 mL pH 7的磷酸 -檸檬酸緩沖溶液和 2.5 mL二氯甲烷,蓋塞后室溫振蕩 2 h進行酶解反應。將反應液以 3 000 r/min離心 20 min。移取 50μL二氯甲烷吸收液加入到 3 mL 20%氨水乙醇溶液中,50℃恒溫水浴反應 2 h,反應結束后冷卻,以 50μL二氯甲烷加 3 mL 20%氨水乙醇溶液作空白,測定異硫氰酸酯 (ITC)在 235、245、255 nm波長處的吸光度。用 3 mL 95%乙醇代替 20%氨水乙醇溶液按上法操作,并以50μL二氯甲烷加 3 mL 95%乙醇作空白,測定惡唑烷硫酮 (OZT)的吸光度。按下列公式計算硫苷含量:

OD245校=OD245-(OD235+OD255)/2

OZT(mg/g)=OD245校×22.1

ITC(mg/g)=OD245校×28.55

硫苷(mg/g)=OZT+ITC

1.3.5 菜籽粕的酶水解

將菜籽粕和 0.25%亞硫酸鈉水溶液加入到反應容器中,置于水浴加熱至 50℃,用 4 mol/L NaOH調節至 pH 8.0,再加入堿性蛋白酶 Alcalase于攪拌下水解,水解參數為:基質質量分數 5%,酶與基質比3%,pH 8.0,反應溫度 50℃。反應過程中加入 4 mol/L的NaOH維持 pH值恒定。反應 120 min后用鹽酸調節反應物至pH 4.3,并于 50℃維持30 min滅酶。將水解混合物以 4 000×g離心20 min除去不溶物,得到上層清液。取樣用凱氏定氮法測定上層清液的蛋白含量,計算蛋白提取率。將上層清液分為兩部分,一部分直接噴霧干燥得到水解物 P1,另一部分留待膜分離。噴霧干燥時熱空氣的進口溫度為180℃,出口溫度為 85℃。另用水代替 0.25%亞硫酸鈉水溶液按上法進行酶水解,水解后進行噴霧干燥,得到的水解物作為不加亞硫酸鈉的菜籽蛋白酶水解對照物 P2。

1.3.6 菜籽蛋白水解液的膜分離

上述酶水解時留存的部分水解液使用截留分子質量為 3 000 u的膜進行超濾,以除去亞硫酸鈉、無機鹽和硫苷等有毒和抗營養物質。膜面積為0.1 m2,超濾液的溫度為 40℃,超濾濃縮因子為 2,超濾后再進行透析過濾(diafiltration),透析過濾體積倍數為 2。最后將膜上溶液進行噴霧干燥,得到經超濾的蛋白水解物 PF1。

1.3.7 水解度的測定方法

蛋白質的水解度 (DH)是指蛋白質中的肽鍵被水解的百分數,其計算公式為:

DH=(h/htot)×100%

式中:h為每克被水解蛋白的肽鍵的物質的量/mmol;htot為每克原料蛋白中肽鍵的物質的量/ mmol。

采用 pH-stat法測定水解過程中的水解度[4],即根據水解過程中為保持反應液 pH值不變而加入的NaOH的量按下式計算水解度:

式中:B為保持 pH不變而加入的 NaOH體積/ mL,Nb為NaOH的濃度,Mp為蛋白質的質量/g;α為水解時α-NH2的平均離解度。

1.3.8 凝膠層析測定菜籽肽的分子質量分布

菜籽肽的分子質量分布采用凝膠層析法測定,所用的凝膠柱為 Superose 12 10/300GL(10×300 mm),使用紫外檢測器于 215 nm檢測。洗脫液為pH等于 7的 0.15 mol/L NaCl和 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液,樣品液先經 0.45μm膜過濾,進樣量為 500μL,洗脫液流速為 0.8 mL/min。取牛血清蛋白(67 000 u)、細胞色素 (12 700 u)、VB12(1 355 u)和氧化型谷胱甘肽(612 u)為分子質量標準。

2 結果與討論

2.1 膜分離清除菜籽水解物中的硫苷

加拿大菜籽粕的主要組分見表 1,其蛋白質含量較高,值得進一步開發利用。

表 1 加拿大菜籽粕的主要組分的含量

加拿大菜籽粕的硫代葡萄糖苷含量見表 2。硫苷是菜籽粕中影響最大的有害物質,在芥子酶作用下水解可生成異硫氰酸酯和惡唑烷硫酮等有毒物質[5],這些有毒物質的存在使菜籽粕既使用作飼料也受到限制,只有盡量降低或除去硫苷才能有效利用菜籽粕及其蛋白。表 2顯示經過 Alcalase水解得到的水解物中的硫苷含量大于菜籽粕,說明硫苷易溶于水,在酶水解時被提取到水解液中,使得菜籽蛋白水解物 P1中的硫苷含量增加。硫苷的增加將嚴重影響蛋白水解物的應用。表 2同時顯示了膜分離對于硫苷的去除作用。雖然本試驗膜分離的超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數都不大,但去除硫苷的效果還是明顯的,膜分離后硫苷的質量分數降到未經膜分離處理的 28.7%。如果提高超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數,應能進一步減少水解物的硫苷含量。

表 2 膜分離對菜籽蛋白水解物中的硫苷含量的影響/mg/g

2.2 亞硫酸鈉對Alcalase水解菜籽粕的速率的影響

圖 1顯示 Alcalase水解菜籽粕時添加亞硫酸鈉對反應速率的影響。從圖 1可知,不管是否添加Na2SO3,堿性蛋白酶水解菜籽蛋白在前 30 min的水解速度最快,之后的速度漸趨平穩。而添加亞硫酸鈉的水解速度明顯大于不添加的反應,且主要體現在前 30 min水解時兩者的速度差別較大,之后的 90 min時間里兩者的水解速度差別較小,水解 120 min時加與不加亞硫酸鈉的水解度分別為 12.1%和7.7%,前者是后者的 1.6倍。

Guerard等[6]認為酶水解反應速度隨時間減小是由于以下幾個因素引起的:

(1)基質分子中可被酶水解的肽鍵的濃度逐漸減少;

(2)存在酶抑制酶,它們在水解過程中不斷溶解;

(3)水解過程中酶的失活,這是由于酶受熱不穩定性以及酶本身被水解的可能性造成的。

亞硫酸鈉作為一種還原劑能斷裂蛋白質分子間和分子內的二硫鍵,亞硫酸鈉本身也容易通過超濾等方法除去,因此低濃度的亞硫酸鈉常用于斷裂食品蛋白中的二硫鍵[7-8]。Hamada[9]報道添加 0.005 mol/L亞硫酸鈉可增加堿性蛋白酶Optimase的活性,提高其水解米糠蛋白的速度。

Vioque等[10]研究菜籽分離蛋白中存在的堿性蛋白酶 Alcalase的抑制劑,發現這些物質的分子質量約為 18 000 u,與菜籽分離蛋白相比,其組成中的含硫氨基酸的質量分數較高,達到 8.8%,其中半胱氨酸的含量是菜籽分離蛋白的 3倍以上,蛋氨酸的含量是后者的 2倍以上,而菜籽分離蛋白的含硫氨基酸質量分數僅為 3.3%。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的研究結果表明堿性蛋白酶抑制劑分子中存在二硫鍵將含硫單元連接起來,這些二硫鍵可防止抑制劑被蛋白酶水解[11]。試驗中添加亞硫酸鈉的水解速度明顯大于不添加的反應,可能由于亞硫酸鈉斷裂二硫鍵的作用,破壞了菜籽蛋白中存在的堿性蛋白酶抑制劑分子,使之失去對于堿性蛋白酶活性的抑制作用;同時,亞硫酸鈉斷裂菜籽蛋白二硫鍵,使得斷裂后的菜籽蛋白分子更容易與蛋白酶接觸,有利于兩者相互作用,從而提高酶水解速率。

圖 1 亞硫酸鈉對Alcalase水解菜籽粕的速率的影響

2.3 亞硫酸鈉對水解物顏色和提取率的影響

表 3列出了添加和不添加亞硫酸鈉得到的菜籽蛋白酶解物的顏色和提取率。

表 3 亞硫酸鈉對菜籽粕水解物顏色和蛋白提取率的影響

表 3顯示水解時添加亞硫酸鈉的水解物的顏色較淺。菜籽粕中含有酚類化合物,可在水解和干燥時氧化,使水解物顏色有所加深。亞硫酸鈉是一種還原劑,可減少酚類化合物氧化。由表 3可知,水解時添加亞硫酸鈉可提高水解物的蛋白提取率,這可能由于添加亞硫酸鈉提高了菜籽蛋白的水解度,使得水解物分子變小,水溶性增加的緣故。

2.4 凝膠層析結果分析

添加和不添加亞硫酸鈉的菜籽蛋白水解物的凝膠層析結果見圖 2和圖 3。比較圖 2、圖 3可知,未添加亞硫酸鈉的水解物在凝膠柱中先流出的組分含量較高,按照凝膠層析分離原理,這部分組分的分子質量較大,意味著未添加亞硫酸鈉的水解物中蛋白質和大分子肽的數量大于添加亞硫酸鈉的水解物。圖 2中 10 000 u以上的峰面積占33.5%,而圖 3中 10 000 u以上的峰面積僅占7.8%。上述結果和圖 1所示的水解結果是一致的,即亞硫酸鈉能夠提高 Alcalase水解菜籽蛋白的速率和水解度。

3 結論

3.1 用堿性蛋白酶 alcalase水解菜籽粕制取多肽時,可使用膜分離有效除去硫苷等有害物質。

3.2 菜籽粕水解時添加低濃度亞硫酸鈉可明顯增加酶水解速率,提高蛋白提取率,同時水解物顏色較淺。

3.3 凝膠層析顯示 alcalase水解菜籽粕制取多肽時添加亞硫酸鈉可減少大分子多肽的比例。

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Preparation of Peptides by Hydrolysis of RapeseedMealwith Alcalase in Presence of Sodium Sulfite

YanMeirong Wang Dandan Ju Xingrong
(College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics Key Laboratory of
Grain and OilsQuality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province,Nanjing 210003)

Peptideswere prepared directly by hydrolysis of rapeseed mealwith Alcalase.Effects of sodium sul2 fite on the proteolysis and the separation effectof glucosinolate bymembrane processingwere investigated.Results:So2 dium sulfite can increase the activity ofAlcalase and change the molecularweight distribution of hydrolysates,resul2 ting in more proportion of smaller peptides by disulfide bond cleavage in protein molecules and by possible i mpact on Alcalase inhibitors.In addition,glucosinolate can be reduced or eliminated bymembrane processing.When the hydrol2 ysate of rapeseed meal is ultrafiltrated and diafitrated with a membrane of 3 ku molecularweight cut-off,and mean2 while the concentration factor of ultrafiltration and the volume multiple of diafiltration both are 2,the glucosinolate content of hydrolysate decreases to 0.39 mg/g from 1.36 mg/g.

rapeseed,sodium sulfite,proteolysis,degree of hydrolysis

TS201.2 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)03-0045-05

863計劃(2007AA10Z331)

2009-03-26

嚴梅榮,男,1947年出生,教授,谷物化學