飼用屎腸球菌的篩選、鑒定及其生物學特性

王婷婷李愛科易建明陶浩瀚汪 洋

(國家糧食局科學研究院1,北京 100037)

(華中農業大學動物科技學院2,武漢 430070)

飼用屎腸球菌的篩選、鑒定及其生物學特性

王婷婷1李愛科1易建明2陶浩瀚1汪 洋1

(國家糧食局科學研究院1,北京 100037)

(華中農業大學動物科技學院2,武漢 430070)

分別采用腸球菌選擇性培養基(EC)從健康嬰兒的糞便、健康仔豬的腸道及糞便中分離篩選了 4株屎腸球菌,分別命名為 EfB、Ef1-2、Ef3-4、Ef4-1,利用 Biolog自動微生物分析系統鑒定結果表明,它們都是屎腸球菌,而且經16S rRNA基因序列測序比較分析,表明這4株菌與數據庫中已發表的屎腸球菌16S rRNA序列(AccessionNo.AY675247)同源性均為 99%,兩者鑒定結果一致。試驗表明,所篩得菌株生長速度較快,且對致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌都有較強的抑制作用,其中對大腸桿菌K99的抑菌效果最好。屎腸球菌新菌種的鑒定與篩選為開發新型微生態類飼料添加劑提供了幫助。

屎腸球菌 Biolog自動微生物分析系統 16S rRNA鑒定 生長代謝曲線 抑菌能力

飼用抗生素雖在動物保健和畜牧生產中發揮了重要作用,但是長期使用及濫用飼用抗生素的弊端正日益受到重視。微生態制劑是通過改善寄主腸道菌群平衡而發揮有益作用的活的益生菌制劑,以其綠色安全、無毒副作用、無殘留的優點逐步成為替代抗生素類添加劑的主力軍。屎腸球菌屬于乳酸菌,由于它生長速度快,有較好的黏附能力,能產生乳酸及一些抗菌物質[1]被廣泛的用作為益生菌制劑。屎腸球菌在環境中廣泛存在,并且屬于腸道共生菌[2],在很多動物新出生的 2～3 d內占優勢地位[3],并且是一種兼性厭氧的乳酸菌,與厭氧、培養保存條件苛刻的雙歧桿菌相比,更適合于生產和應用。1989年美國 FDA就公布它為可直接用于動物的菌種之一。

近 20年來,一系列商品化自動鑒定系統相繼推出并在應用中取得理想效果,如 V ITEK系統、M ID I系統、Biolog系統、SENSITITRE系統、AUTOSCEPTOR系統以及M ICROSCAN系統等[4],其中細胞脂肪酸分析的M ID I系統、碳源利用分析的 Biolog系統與DNA序列分析的 16S rRNA基因進化發育系統已經成為目前國際上細菌多相分類鑒定常用的技術手段[5-7]。

從初生健康嬰兒糞便、8日齡健康仔豬糞便、5日齡健康仔豬回腸黏膜、空腸黏膜中篩選 4株產酸能力強,抑菌效果明顯的屎腸球菌,并采用 Biolog和16S rRNA兩種鑒定方法對其進行了鑒定,并對其生長特性及抑菌特性進行了研究,以期得到可廣泛應用于飼料行業的屎腸球菌新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌種

大腸桿菌 K88,大腸桿菌 K99,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌及巴氏桿菌:中國獸醫藥品監測所。

1.1.2 培養基

屎腸球菌選擇性培養基 (EC):胰蛋白胨 2 g,酵母浸膏 0.5 g,葡萄糖 0.2 g,Na2HPO40.4 g,K2HPO40.4 g,瓊脂 2 g,雙蒸水 100 mL,pH 7.4,冷至 45～50℃。加入 NaN3至終質量濃度為 0.000 4 g/mL 2,3,5-氯化三苯四氮唑 (TTC)0.000 1 g/mL,倒平板。MRS、LB和肉湯培養基按常規方法配制。

MRS液體培養基:蛋白胨 10 g,牛肉浸膏 10 g,酵母浸膏 5 g,K2HPO42 g,檸檬酸氫二銨 2 g,葡萄糖20 g,乙酸鈉 5 g,Tween-80 1mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,1000 mL蒸餾水,用1 mol/L NaOH調節至 pH7.0,115℃滅菌 30 min。MRS固體培養基在液體培養基的基礎上加入 1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要試驗儀器

BCN-1360B超凈工作臺:哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;SBA-40C生物傳感儀:山東省科學院生物研究所;梯度 PCR儀;BXT-26-M凝膠電泳成像儀:德國艾本德股份公司;DYY-8C電泳儀:北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 屎腸球菌的分離

無菌采集初生健康嬰兒糞便 1 g,8日齡健康仔豬糞便 1 g,5日齡健康仔豬回腸黏膜,空腸黏膜用滅菌的載玻片刮取回腸、小腸黏液,用滅菌生理鹽水稀釋 104倍,取 0.1mL接種于 EC培養基平板上,37℃厭氧培養 24 h,挑取紫紅色,表面光滑凸起,周邊整齊,直徑1.0～1.5 mm的菌落,傳代于 EC基礎斜面,涂片,革蘭氏染色鏡檢,篩選 G+,圓形或卵圓形,單個、成對或短鏈狀排列的菌株。然后將篩選菌株再在MRS平板上劃線接種純培養。

MRS液體培養基培養 16 h,取樣測乳酸產量,采用牛津杯法[8]對大腸桿菌 K88做抑菌試驗,培養液在 80℃水浴 10 min,取原液 0.4 mL涂板挑取 80℃水浴存活的菌種接到斜面上,選取 80℃水浴存活的菌種,乳酸產量較高,抑菌作用明顯的菌株甘油保種。

1.2.2 pH值測定

將上述的純培養物取 1 mL接種于 100 mL裝有MRS液體培養基的 300 mL的三角瓶中,37℃培養16 h,分別檢測各培養液的 pH值。

1.2.3 屎腸球菌的生理生化指標鑒定

按伯杰氏細菌鑒定手冊[9]中屎腸球菌的生理生化特性,對上述分離的 4株腸球菌進行溫度 (10℃、45℃)、耐酸、耐 NaCl、運動性及糖類發酵等生理生化指標的測定。

1.2.4 屎腸球菌的Biolog鑒定

按照Biolog GP2微生物鑒定微孔板使用手冊和Biolog微生物自動分析系統 -細菌鑒定操作規程的研究[10]所述的操作步驟對所篩的菌種進行 Biolog鑒定。

1.2.5 屎腸球菌 16S rRNA鑒定

1.2.5.1屎腸球菌總DNA的提取

煮沸法提取腸球菌總 DNA:取 1 mL菌液, 12 000 r/min離心 2 min,棄去上清液,加入 1 mL ddH2O,12 000 r/min離心 2 min,棄去上清液,加300μL ddH2O,沸水浴 10 min,放入 -20℃冰浴10 min,12 000 r/min離心 2 min,取上清液于滅過菌的1.5 mL的離心管中。

1.2.5.2 PCR產物擴增及其檢測

正向引物:5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA CGA-3′,反向引物:5′-CGC ACC TTC CGA TAC GGG CTA CCT-3′[11]由上海英駿生物技術有限公司合成。

上游引物(24 bp)1μL,下游引物 (24 bp)1μL, 10×Buffer 5μL,Mg2+4μL,dNTP2μL,Ex Taq酶1μL,模板 3μL,ddH2O35μL。反應程序:預變性95℃,5 min;94℃變性 30 s,58℃退火 30 s,72℃延伸 50 s,30個循環;72℃延伸 5 min。

取 10μL擴增產物加入 2μL溴酚藍染色液,混勻加在 1%瓊脂糖凝膠(含 goldview2.5μL),1×TAE緩沖液中恒壓 80 V電泳 40 min,用凝膠成像儀觀察結果。

1.2.5.3 PCR擴增片段的克隆

采用膠回收試劑盒純化 PCR產物;將純化產物與載體 pMD18-T simper在 16℃連接過夜,將上述產物 10μL與200μL大腸桿菌DH5α感受態細胞混合,按常規 CaCl2方法轉化并涂布于含氨芐青霉素、X-gal、IPTG的 LB平板上,37℃培養 16～18 h,挑取白色菌落做進一步篩選、鑒定。

1.2.5.4 重組質粒的酶切鑒定

將上述白色菌落接種于含氨芐青霉素的 LB液體培養基中,37℃培養 18 h,用質粒抽提 Kit提純重組質粒DNA,取上述提取的質粒DNA分別進行 PCR及 HandШ單酶切驗證,1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.5.5 基因序列測定及分析

將鑒定正確的質粒寄送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.2.6 屎腸球菌生長代謝曲線的測定

將低溫保存的屎腸球菌按 1%接入到MRS培養基中培養 8 h作為種子。將 1 mL種子分別加入100 mL的MRS培養基中,在 37℃,150 r/min培養20 h,每 2 h取樣一次。對所取樣品分別測定 OD600,每個處理做三個重復,記錄數據繪制生長曲線。使用生物傳感儀分別測定各點菌體培養液中葡萄糖消耗量及乳酸產量,記錄數據繪制代謝曲線。

1.2.7 屎腸球菌抑菌能力的測定

采用牛津杯法[8]測定游離培養與微囊化培養屎腸球菌對大腸桿菌 K88、大腸桿菌 K99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及巴氏桿菌的抑制能力。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌篩選菌株的形態特性

在 EC選擇性培養基上挑取紫紅色,表面光滑凸起,周邊整齊,直徑 1.0～1.5 mm的菌落,并篩選G+,圓形或卵圓形,短鏈狀排列的菌株 20株。在MRS培養基上純培養后,通過 pH值測定、乳酸測定篩選出 12株產酸能力強的腸球菌 (12 h培養后 pH值達 4.5左右)。通過抑菌試驗篩選出不同來源的抑菌能力較強的 4株菌,分別編號為B,1-2,3-4,4 -1,圖 1為菌株 3-4的形態圖片。

圖1 菌株3-4的形態圖片

2.2 屎腸球菌的鑒定

2.2.1 生理生化指標鑒定結果

篩選的 4株菌株生理系列化指標測定結果為:革蘭氏陽性菌,能在 10℃和 45℃生長,發酵葡萄糖產酸,可生長于 6.5%NaCl和 40%膽汁鹽環境中,精氨酸產氨,不分解鼠李糖、松三糖和山梨醇,能分解蔗糖、密二糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖,對慶大霉素、卡那霉素、多黏菌素和鏈霉素不敏感,對青霉素、紅霉素、萬古霉素和阿莫西林敏感。具體生理生化鑒定結果見表 1。參照伯杰氏細菌手冊 (第八版)[9],這 4株腸球菌基本符合屎腸球菌的生理生化特性,分別命名為 EfB、Ef1-2、Ef3-4和 Ef4-1。

表 1 EfB、Ef1-2、Ef3-4和 Ef4-1的生理生化特性

2.2.2 Biolog系統鑒定結果

Biolog微生物自動分析系統主要根據細菌對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等 95種碳源的利用情況進行鑒定,其中 A1孔是對照孔。Biolog系統鑒定結果主要有 3個參數,即可能性(Probability,PROB)、相似性 (Si milarity,SI M)和位距 (Distance,D IST),其中 SI M值和D IST值是兩個重要參數,D IST值表示測試結果與數據庫相應數據條的位置,SI M值表示測試結果與數據庫相應數據條的相似程度[10]。Bi2 olog系統規定:細菌培養 4～6 h,其 SI M≥0.75,培養16～24 h時,SI M≥0.5時,系統自動給出鑒定結果為種名,SI M值越接近 1.00,鑒定結果的可靠性越高;當SI M值小于 0.5,但鑒定結果中屬名相同的結果的 SI M值之和大于 0.5時,自動給出的鑒定結果為屬名。鑒定結果見表 2,4株菌均為屎腸球菌。

表 2 4株菌的Biolog系統鑒定結果

2.2.3 16S rRNA鑒定結果

PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳、溴酚藍染色后在凝膠成像儀下觀察,結果見圖 2。

圖2 16S rRNA基因 PCR反應產物凝膠電泳圖譜

由圖 2可見,4株菌在 1 000～2 000 bp間都有一個明顯的條帶,而 16S rRNA基因含有高度保守的基因片段,大約 1.5 kb左右,這表明 PCR反應擴增出了預期長度的基因序列。

以上擴增的 PCR產物克隆連接和轉化后,選出含有該擴增片段的重組質粒的轉化子,重組體再經酶切、PCR鑒定后 (圖 3),均出現了預期大小的片段。PCR鑒定結果表明,4株菌都在 1 500 bp左右出現了特異性擴增條帶,HandШ單酶切驗證結果表明, 4株菌都在 4 200 bp左右出現了特異性擴增條帶,這表明質粒重組比較成功。

圖3 重組質粒DNA、PCR驗證結果及HandШ單酶切驗證圖譜

將 4株菌測得的序列應用BLAST程序與數據庫中已發表的屎腸球菌 16S rRNA序列 (Accession No. AY675247)進行相似性比較,同源性均為 99%,說明篩選的 4株菌經 16S rRNA鑒定均為屎腸球菌。

2.3 屎腸球菌生長代謝曲線測定結果

篩選所得的 4株屎腸球菌的生長代謝結果如圖4所示。嬰兒糞便、乳豬腸道及糞便中所分離的屎腸球菌生長代謝曲線基本相似,它們的生長速度快,在4 h就進入了對數增長期,并持續到 14 h,14～18 h進入穩定期,18 h后進入衰亡期。隨著菌體的生長,乳酸產量也逐漸升高,在 12 h后基本趨于穩定。屎腸球菌生長速度快,生長周期短是其作為益生菌制劑的一個很大的優勢,為其作為仔豬飼料添加劑奠定了基礎。

圖4 4株屎腸球的生長和代謝曲線

2.4 屎腸球菌抑菌能力測定結果

圖 5 4株屎腸球對 5株指示菌的抑菌圈直徑

致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌是較為常見的引起仔豬腹瀉的致病菌。由圖 5可知,屎腸球菌對致病型大腸桿菌K88、K99、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌及沙門氏菌都有較強的抑制作用,抑菌圈直徑都在 11～23 mm之間,其中對大腸桿菌 K99的抑菌效果最好,抑菌圈直徑在 19～23 mm之間。這也是屎腸球菌作為益生菌制劑的一個必要的前提。

3 討論與結論

利用已經過常規理化鑒定的、從嬰兒糞便、乳豬腸道及糞便中分離的 4株屎腸球菌,采用Biolog系統鑒定與 16S rRNA序列分析相結合的方法進一步鑒定,確定這 4株菌均為屎腸球菌,結果表明所篩得菌株生長速度快,均有很好的抑菌效果。Biolog系統鑒定結果與傳統鑒定結果一致。與傳統鑒定方法相比,Biolog自動微生物分析系統快速、便捷、有效,特別是對于沒有目的性的未知微生物,Biolog系統可為鑒定者提供方向性指導。在利用 Biolog系統鑒定微生物時,為獲得準確的結果,在操作過程中需掌握很多關鍵因素,如適當的菌懸液濃度,適宜的培養溫度,消除菌懸液中的菌塊等,但首要條件是保證微生物的純粹性。由于 16S rRNA序列的保守性存在的普遍性,以及核酸序列本身的穩定性定性、序列分析的重現性極高,基于當今分析技術的改進,應用 16S rRNA作為分子指標,可以實現快速、微量、準確簡便地對微生物進行分類鑒定。分子分類正是在從研究的目的過渡到研究的手段。Biolog系統與 16S rRNA雙重鑒定更加說明鑒定結果的可靠性,而屎腸球菌的鑒定與篩選為開發新型微生態類飼料添加劑提供了幫助。

本研究證明了所篩選的屎腸球菌對致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌均具有很好的抑菌效果,但是后續工作還很多,如對所篩選的屎腸球菌的抗逆性進行測定、選擇適宜的包埋方式及體內動物試驗飼養效果的評價等。

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Screening,Identification and Characterization of Enterococcus faeciumfor Feed Use

Wang Tingting1LiAike1Yi Jianming2Tao Haohan1Wang Yang1

(Academy of State Administration of Grain1,Beijing 100037)
(College ofAnimal Science and Technology,Hua ZhongAgriculturalUniversity2,Wuhan 430070)

Four new strainsof Enterococcus faecium were screened from healthy infant feces,piglet intestine and feces in EC medium,which were named as EfB,Ef1-2,Ef3-4 and Ef4-1.Theywere all identified asEnterococcus faeciumbyBiolog automatic microbe analysis system.16S rRNA identification comparingwith GenBank indicated thatthere was 99%homology withEnterococcus faeciumstrain SF(Accession No.AY675247).Results:All the four new strains have faster growth rate and can significantly inhibit growth of Escherichia coli K88,Escherichia coli K99, Staphylococcus Aureus,PasteurellosisB acillusandSalm onella,especiallyEscherichia coliK99.The identification results with t wo ways are consistent.The screening,identification and developmentof newEnterococcus faeciumwould be ben2 eficial for the development ofmicro-ecological agents for feed use.

Enterococcus faecium,Biolog automaticmicro-analysis system,identification by 16S rRNA,growth and metabolis m curve,bacteriostatic ability

Q93-331 文獻標識碼:B 文章編號:1003-0174(2010)03-0089-06

國家科技支撐計劃(2006BAD12B04),中央級公益性科研院所基本科研業務費專項課題(ZX0702)

2009-04-07

王婷婷,女,1985年出生,碩士,動物營養

李愛科,男,1963年出生,研究員,動物營養