黏紅酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工藝研究

王 敏 李市場 劉紅霞 朱朝陽

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽 471003)

黏紅酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工藝研究

王 敏 李市場 劉紅霞 朱朝陽

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,洛陽 471003)

采用酸熱耦合超聲波法對(duì)黏紅酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工藝進(jìn)行研究。選取酸處理時(shí)間、沸水浴時(shí)間、超聲處理時(shí)間、超聲功率、提取液配比、提取時(shí)間、NaCl濃度等 7個(gè)微生物油脂提取相關(guān)因素,首先通過 Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出 3個(gè)顯著因子:提取液配比 (P=0.010 5)、超聲處理時(shí)間(P=0.010 5)、酸處理時(shí)間 (P=0.036 4)。然后通過 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì) 3個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化組合,得到最佳工藝條件,即酸處理時(shí)間 34 min,超聲處理時(shí)間 7.5 min,提取液配比 1.9∶1。與原始工藝條件相比,1 g濕菌所得油脂重量從 42 mg增加到 57.33 mg,提高了 36.5%。

黏紅酵母 油脂提取 Plackett-Bur men 設(shè)計(jì)Box-Behnken設(shè)計(jì)

生物油脂主要包括動(dòng)物油脂、植物油脂和微生物油脂[1]。其中微生物油脂是單細(xì)胞油脂 (Single cell oil,SCO),不僅可以作為食用油,也可以作為新能源,替代日益枯竭的石油[2]。與動(dòng)、植物油脂相比,它具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和氣候變化的限制、生產(chǎn)成本低以及保護(hù)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[3-4],因此這種新型油脂備受關(guān)注,具有廣闊的發(fā)展前景[5]。

油脂提取技術(shù)是影響生物油脂能否被廣泛應(yīng)用的重要因素之一[6]。而微生物油脂屬于胞內(nèi)油脂,其提取首先需要破碎細(xì)胞,因此細(xì)胞破碎方法至關(guān)重要。目前主要采用的細(xì)胞破碎方法有酸熱法、超聲波法、反復(fù)凍融法等[7],但對(duì)這幾種方法的比較及聯(lián)合使用還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)研究了不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)黏紅酵母 Rhodotorula glutinis油脂提取的影響,采用有機(jī)溶劑(氯仿 -甲醇)法萃取油脂,并通過Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì)和 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)細(xì)胞破碎及油脂提取過程中的相關(guān)因素進(jìn)行顯著性篩選和油脂提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 菌種

黏紅酵母 (Rhodotorula glutinis)31596:中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基:在 5°Bé麥芽汁的基礎(chǔ)上加入 2%蛋白胨、2%瓊脂,pH 5.8,0.7×105Pa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基:在 5°Bé麥芽汁的基礎(chǔ)上加入 2%蛋白胨,pH 5.8,0.7×105Pa滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):葡萄糖:80,蛋白胨:1.8, (NH4)2SO4:1.11,KH2PO4:2.5,pH5.8,0.5×105Pa滅菌 30 min。

種子液制備:250 mL三角瓶裝液量 30 mL,從斜面培養(yǎng)基上刮取 3環(huán)菌種至瓶內(nèi),28℃190 r/min搖床培養(yǎng) 24 h。

發(fā)酵培養(yǎng):250 mL三角瓶裝液量40 mL,接入10%種子培養(yǎng)液,28℃190 r/min搖床培養(yǎng) 96 h。

1.3 酵母細(xì)胞破碎的處理

酸熱法:將發(fā)酵液離心集菌,稱取 1 g濕菌體,加入 4 mol/L鹽酸 10 mL,振蕩混勻,室溫下放置30 min,然后沸水浴 3 min,立即放于 -20℃速冷。

超聲波法:將發(fā)酵液離心集菌,稱取1 g濕菌體,加入10 mL蒸餾水振蕩混勻后,超聲處理,功率200W,全程時(shí)間 5 min,其中脈沖時(shí)間 3 s,間隔時(shí)間 4 s。

酸熱耦合超聲波法:將發(fā)酵液離心集菌,稱取1 g濕菌體,加入 4 mol/L鹽酸 10 mL,振蕩混勻,室溫下放置 30 min,然后沸水浴 3 min,立即放于 -20℃速冷,最后超聲處理,功率200W,全程時(shí)間 5 min,其中脈沖時(shí)間 3 s,間隔時(shí)間 4 s。

1.4 油脂提取與測(cè)定

破碎后的菌液,加入 2倍體積的氯仿 -甲醇提取液,振蕩混勻,4 000 r/min離心 25 min,取下層氯仿溶液,與等體積 0.15%氯化鈉溶液混勻,4 000 r/min離心25 min后,將下層氯仿溶液轉(zhuǎn)移至錐形瓶內(nèi),室溫自然揮發(fā)氯仿 36 h后稱重。根據(jù)下式計(jì)算油質(zhì)量:

W=W2-W1。

式中:W為油脂的質(zhì)量/mg;W1為錐形瓶的質(zhì)量/mg;W2為錐形瓶和油脂的總質(zhì)量/mg。油脂質(zhì)量均為 1 g濕菌提取所得。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同細(xì)胞破碎方法對(duì)微生物油脂提取的影響

比較了酸熱法、超聲波法和酸熱耦合超聲波法 3種不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)微生物油脂提取的影響,從而找出效果最好的細(xì)胞破碎方法,結(jié)果見圖 1。

圖1 不同細(xì)胞破碎方法對(duì)油脂提取的影響

由圖 1中可以明顯看到,酸熱耦合超聲波法所得油脂最多,達(dá) 42.67 mg。這是因?yàn)樗釤岱ㄖ饕名}酸對(duì)細(xì)胞壁中糖及蛋白質(zhì)等成分的作用,使原來結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松,再經(jīng)沸水浴及速冷處理,使細(xì)胞壁進(jìn)一步被破壞,細(xì)胞破碎效果較好[8-9];而超聲波法是一種物理破碎方法,主要利用其對(duì)媒質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用,達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。由于酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁比較厚,單一的細(xì)胞破碎方法不能達(dá)到較好的細(xì)胞破碎效果,因此試驗(yàn)選用酸熱耦合超聲波法來破碎細(xì)胞,即利用酸熱法對(duì)細(xì)胞壁的侵蝕作用和超聲波的機(jī)械、空化作用,油脂提取效果最好。

2.2 Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響油脂提取的顯著因素

在采用酸熱耦合超聲波法油脂提取的過程中,選取酸處理時(shí)間、沸水浴時(shí)間、超聲處理時(shí)間、超聲功率、提取液配比 (VCHCl3∶VCH3OH)、提取時(shí)間和 NaCl濃度等 7個(gè)影響微生物油脂提取的相關(guān)因素,研究它們對(duì)提油的影響。通過用 Plackett-Burmen[10]試驗(yàn)設(shè)計(jì)從眾多的考察因素中快速、有效地篩選出顯著因素,供進(jìn)一步詳細(xì)研究。

利用 Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)上述 7個(gè)因素進(jìn)行研究,每個(gè)因素分別選取 2個(gè)水平:低水平“-1”和高水平“+1”,響應(yīng)值為最后所得油的質(zhì)量(mg)。表 1列出了因素的編碼及水平,X1～X9分別編碼了 9個(gè)因素,其中 X3和 X6是空項(xiàng)用于估計(jì)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表 2,表中 1～12分別代表 12組試驗(yàn),按照設(shè)計(jì)好的方案進(jìn)行油脂提取試驗(yàn),每組重復(fù) 3次。

表 1 Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平范圍

表 2 Plackett-Burmen試驗(yàn)方案及響應(yīng)值

通過對(duì)表 2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知,超聲處理時(shí)間 (P=0.010 5)、提取液配比 (P=0.010 4)、酸處理時(shí)間 (P=0.036 4)對(duì)油脂提取具有顯著影響,其他因素不顯著。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化油脂提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

影響油脂提取的顯著因素為酸處理時(shí)間、超聲處理時(shí)間、提取液配比,其他 4個(gè)因素在所選水平內(nèi),對(duì)油脂提取沒有顯著影響。將非顯著因素固定在上述試驗(yàn)低水平的情況下,利用 Box-Behnken[11]試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì) 3個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。以酸處理時(shí)間 (X1)、超聲處理時(shí)間 (X2)、提取液配比 (X3)為變量,每個(gè)變量按低、中、高 3個(gè)水平分別以 -1、0、+1進(jìn)行編碼,試驗(yàn)因素及水平見表 3。

表3 響應(yīng)面分析因素和水平

2.3.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)表 3的因素和水平,以 X1、X2、X3為自變量,以最后所得油脂質(zhì)量為響應(yīng)值 (Y1),試驗(yàn)方案及結(jié)果見表 4。表 4中 1～15分別代表 15組試驗(yàn),其中 13～15為中心試驗(yàn),重復(fù) 3次,用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。按照設(shè)計(jì)好的方案進(jìn)行微生物油脂提取試驗(yàn),每組重復(fù)3次。

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.3.3 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

通過 SAS9.1軟件對(duì)表 4的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,獲得油脂質(zhì)量(Y1)對(duì)自變量酸處理時(shí)間 X1、超聲處理時(shí)間 X2、提取液配比 X3的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下:

式中 Y1代表所得油脂重量,X1、X2、X3分別代表酸處理時(shí)間、超聲處理時(shí)間、提取液配比。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表 5。由表 5可知,對(duì)油脂重量所建立的回歸模型極顯著(P<0.01),模型的失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說明模型可信。且該模型的決定系數(shù) R2=0.993 8,校正決定系數(shù)Adj R2=0.982 7,因此該模型能對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬合,可用于分析和預(yù)測(cè)黏紅酵母濕菌體所得油脂質(zhì)量的情況。

從表 5中還可以看出該模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)以及交互相的 P值均小于 0.05,說明三因素之間不是簡單的線性關(guān)系。其中酸處理時(shí)間與提取液配比的交互作用極顯著,酸處理時(shí)間與超聲處理時(shí)間以及超聲處理時(shí)間與提取液配比的交互作用顯著。并且 X2、X3、X1X1、X2X2和 X3X3對(duì)油脂提取的影響均為極顯著(P< 0.01),X1為顯著(P<0.05),三因素的主效應(yīng)關(guān)系為:提取液配比 >超聲處理時(shí)間 >酸處理時(shí)間。

表5 方差分析表

2.3.4 響應(yīng)面圖及等高線

根據(jù)表 5的方差分析可知,三因素對(duì)油脂提取均具有顯著影響。在保持一個(gè)因素為最優(yōu)條件下,其它兩個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系用三維坐標(biāo)圖表示,可以直觀反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響關(guān)系,見圖 2、圖3、圖 4。

由 3組響應(yīng)面圖可知提取液配比對(duì)油脂提取具有顯著影響,表現(xiàn)為曲線較陡,而酸處理時(shí)間和超聲處理時(shí)間的曲線則較為平滑。圖 2可以看出酸處理時(shí)間和超聲處理時(shí)間都隨著時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢(shì),圖 3、圖 4可以看出提取液配比的增長趨勢(shì)明顯高于酸處理時(shí)間和超聲處理時(shí)間。

由 3組等高線圖可知圓心處存在極值點(diǎn),并可直觀地看出酸處理時(shí)間和提取液配比的交互作用最顯著(見圖 2),而酸處理時(shí)間和超聲處理時(shí)間、超聲處理時(shí)間和提取液配比的交互作用與之相比較小(見圖 3、圖 4)。這是因?yàn)榈雀呔€的形狀能反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。

圖 2 響應(yīng)曲面及等高線圖 Y=f(X1,X2)

圖 3 響應(yīng)曲面及等高線圖 Y=f(X1,X3)

圖 4 響應(yīng)曲面及等高線圖 Y=f(X2,X3)

2.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面分析得到酸熱耦合超聲波法提取黏紅酵母 Rhodotorula glutinis油脂的最佳工藝參數(shù)為:酸處理時(shí)間34 min,超聲處理時(shí)間7.5 min,提取液配比 1.9∶1。在此條件下,油脂質(zhì)量的理論預(yù)測(cè)值可達(dá)到 60.47 mg。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性,采用上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),即酸處理時(shí)間 34 min,超聲處理時(shí)間 7.5 min,提取液配比 1.9∶1,經(jīng)過 3次平行試驗(yàn),結(jié)果見表 6。實(shí)際油脂質(zhì)量的平均值為57.33 mg,與理論預(yù)測(cè)值 60.47 mg接近,相對(duì)誤差為5.48%,證明該回歸模型可靠,可以應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化黏紅酵母油脂提取工藝。

表6 優(yōu)化條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

3.1 通過比較酸熱法、超聲波法和酸熱耦合超聲波法對(duì)黏紅酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取的影響,結(jié)果顯示酸熱耦合超聲波法效果最好。

3.2 在酸熱耦合超聲波法提取油脂的過程中,選取酸浸泡時(shí)間、沸水浴時(shí)間、超聲處理時(shí)間、超聲功率、提取液配比、提取時(shí)間、NaCl濃度等 7個(gè)微生物油脂提取相關(guān)因素,通過 Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì),以P<0.05為準(zhǔn),篩選出酸處理時(shí)間 (P=0.036 0)、超聲處理時(shí)間(P=0.010 5)、提取液配比 (P=0.010 5) 3個(gè)對(duì)黏紅酵母 Rhodotorula glutinis微生物油脂提取具有顯著影響的因素。

3.3 在 Plackett-Burmen試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)酸處理時(shí)間、超聲處理時(shí)間、提取液配比 3個(gè)顯著因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,得到最佳工藝參數(shù)為酸處理時(shí)間 34 min,超聲時(shí)間 7.5 min,提取液配比 1.9∶1。與原始工藝條件相比,1 g濕菌中所得油脂質(zhì)量從 42 mg增加到 57.33 mg,提高了36.5%。

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Study on ExtractingMicrobialOil fromRhodotorula glutinis

WangMin Li Shichang Liu Hongxia Zhu Zhaoyang
(Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003)

The technics of extractingmicrobial oil fromRhodotorula glutiniswith acid-heating coupling ultra2 sonic was studied.Firstly,seven influencing factors for extraction rate,i.e.,HCl marinating time,boiling water bath time,ultrasonic treating time,ultrasonic power,ratio of extracting solution(VCHCl3︰ VCH3OH),extracting time, and concentration ofNaCl,were used in Plackett-Burnam design to select three significant factors.Then the three factorswere opti mized by Box-Behnken design.Results:The three significant factors are HCL marinating time (P =0.036 4),ultrasonic time(P = 0.010 5)and ratio of extracting solution (VCHCl3︰ VCH3OH) (P= 0.010 5).The optimized extraction conditions are HCl marinating time 34 min,ultrasonic treating ti me 7.5 min, and ratio of extracting solution(VCHCl3︰VCH3OH)1.9:1.The oilweight of 1 gwet thalli increases from 42 mg under original conditions to 57.33 mg under the optimized conditions,an increment by 36.5%.

rhodotorula glutinis,extracting oil,Pplackett-Bur men design,Box-Behnken design

Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)06-0071-05

中國科學(xué)院等離子體物理研究所暨安徽省離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2008B004)

2009-06-15

王敏,女,1984年出生,碩士,高產(chǎn)油脂菌株的選育

李市場,男,1976年出生,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,微生物育種