二甲基亞砜對紅霉素合成的影響研究

丁盼盼,高淑紅,陳長華,葉蕊芳,武 培,馬朝安

（1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海200237;2.河南天方藥業股份有限公司,河南駐馬店 463000）

二甲基亞砜對紅霉素合成的影響研究

丁盼盼1,高淑紅1,陳長華1,葉蕊芳1,武 培2,馬朝安2

（1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海200237;2.河南天方藥業股份有限公司,河南駐馬店 463000）

分別研究了搖瓶和發酵罐中二甲基亞砜對紅霉素合成的影響。通過搖瓶實驗確定了適宜的二甲基亞砜體積分數和添加時間,并在15 L發酵罐中考察了二甲基亞砜對紅霉素合成代謝的影響。結果表明,在紅色糖多孢菌發酵48 h時,向發酵罐的培養基中流加體積分數為0.16%的二甲基亞砜,紅霉素效價可達7961 U·mL-1,比對照提高11.6%;二甲基亞砜可以提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量,從而提高紅霉素產量。

紅霉素;二甲基亞砜;生物合成;P450單加氧酶

紅霉素（Erythromycin,Er）是一類大環內酯類抗生素,包括紅霉素A（ErA）、紅霉素B（ErB）、紅霉素C（ErC）、紅霉素D（ErD）、紅霉素 E（ErE）和紅霉素 F（ErF）。在臨床上廣泛應用的是紅霉素A,它的抑菌活性最高,最初是從一種放線菌——紅色糖多孢菌（S2accharopolyspora ery thraea）中分離出來的[1]。中國藥典（95版）規定紅霉素成品的生物效價按無水物計算,每1 mg效價不得少于920個紅霉素單位。紅霉素A的生物合成途徑如圖1所示[2]。

圖1 紅霉素A的生物合成Fig.1 Biosyn thesis of erythromycin A

從圖1可以看出,欲得到高產率及高含量的紅霉素A,紅霉素D是一個很關鍵的中間產物。紅霉素D沿兩條分支途徑轉化為紅霉素A,途徑 I：紅霉素D在羥基化酶 Ery K的作用下羥基化,生成紅霉素C,然后在甲基化酶 EryG的作用下甲基化,生成紅霉素A;途徑Ⅱ：紅霉素D在 EryG的作用下甲基化,生成紅霉素B,然后在Ery K的作用下羥基化,生成紅霉素A。

據報道[3],對于羥基化反應,小分子有機溶劑[如二甲基亞砜（DM SO）、乙醇、丙酮等]可使細胞色素P450單加氧酶m RNA量增加,最終使細胞色素P450單加氧酶（Ery K）表達量增加。

作者在此考察了DM SO體積分數和添加時間對紅霉素合成的影響,并研究了DM SO對P450單加氧酶含量的影響。

1 實驗

1.1 菌種與原料

紅色糖多孢菌 HD,華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室保藏菌種。

淀粉、黃豆餅粉、糊精,河南天方藥業股份有限公司;其余原料均為市售工業純。

1.2 培養基

搖瓶種子及罐一級種子培養基（%）：可溶性淀粉2.0,糊精 2.5,黃豆餅粉 2.5,玉米漿 0.8,硫酸銨0.18,氯化鈉0.4,碳酸鈣 0.2,豆油 3滴 ·瓶-1,消前p H值7.4。裝量30 mL·（250 mL）-1。

搖瓶發酵培養基（%）：淀粉5.0,黃豆餅粉3.0,玉米漿 0.4,硫酸銨 0.15,碳酸鈣0.4,豆油3滴·瓶-1,葡萄糖25,p H值7.0～7.2。

罐二級種子培養基（%）：淀粉2.0,黃豆餅粉2.5,糊精2.5,玉米漿2.3,硫酸銨0.15,碳酸鈣0.2,豆油0.2,消前p H值7.4。

罐發酵培養基（%）：淀粉2.0,黃豆餅粉2.5,糊精2.5,玉米漿2.3,氯化鈉0.15,碳酸鈣0.2,豆油0.2,消前p H值7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

將種子液于34℃、220～240 r·min-1搖床培養48 h。

1.3.2 發酵培養

搖瓶發酵培養：將接入種子液的發酵液于34℃、220～240 r·min-1搖床培養 168 h。

罐發酵培養：先將甘油管保藏的菌種按10%接種量接入裝有60 m L一級種子培養基的500 m L一級種子瓶中,（34±1）℃培養48 h后;再按10%接種量接入裝量相同的500 m L二級種子瓶中,同溫培養48 h;最后按10%接種量接入裝有10 L發酵培養基的15 L發酵罐中,培養7 d。

1.4 分析與檢測

（1）P450單加氧酶含量的測定：參照文獻[4～6]測定P450單加氧酶含量。

（2）總蛋白含量的測定：采用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。

（3）糖和氨基氮的測定：參照文獻[7],分別采用費林試劑法和甲醛法測定糖和氨基氮含量。

（4）生物效價的測定：參照文獻[8],采用管碟法測定紅霉素生物效價。

（5）化學效價的測定：參照文獻[9],采用磷酸水解法測定紅霉素化學效價。

（6）紅霉素含量的測定：采用 HPLC法測定紅霉素含量。

高效液相色譜儀：717 Plus autosamp ler,2487 Dual absorbance detector,1525 Binary HPLC pump,Waters公司。

色譜柱為反相C18柱RP2C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流動相為乙腈（色譜純）∶0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（分析純）緩沖溶液（32∶68）,流速為1 mL·min-1,檢測波長為205 nm,柱溫為35℃。

2 結果與討論

2.1 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響

分別在搖瓶發酵培養 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時添加0.12%（體積分數,下同）的DM SO,考察其對紅霉素效價的影響,結果見圖2。

圖2 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響Fig.2 Effect of DMSO adding time on chem ical titre of erythromycin

由圖 2 可以看出 ,在發酵 0 h、48 h、72 h、120 h 添加0.12%的DMSO均可提高紅霉素效價,且在發酵48 h添加DM SO時,紅霉素效價達到最大。因此,確定DMSO最適添加時間為48 h。

2.2 DMSO體積分數對紅霉素效價的影響

搖瓶發酵48 h,分別添加0.08%、0.16%、0.24%、0.32%、0.40%、0.48%、0.56%的 DMSO,考察 DMSO體積分數對紅霉素效價的影響,結果見圖3。

圖3 DMSO體積分數對紅霉素效價的影響Fig.3 Effect of DMSO volume fraction on chem ical titre of erythromycin

由圖3可以看出,DM SO體積分數小于0.32%時,紅霉素效價較對照有所提高,最高增加13%;DM 2 SO體積分數為0.40%～0.48%時,紅霉素效價與對照相比,增幅不大;DM SO體積分數為0.56%時,紅霉素效價降低。這可能是因為DM SO體積分數過高抑制了菌體生長,導致紅霉素合成下降。因此,確定DM SO的最適體積分數為0.16%。

2.3 DMSO對紅霉素合成代謝的影響

在15 L FUS-15L（A）發酵罐中,于紅色糖多孢菌發酵48 h時流加0.16%的DM SO,每隔一段時間取樣分析,考察DM SO對紅霉素合成代謝的影響。

2.3.1 DM SO對菌體糖耗速率的影響（圖4）

圖4 DMSO對糖耗速率的影響Fig.4 Effect of DMSO on consum ption rate of sugar

從圖4可以看出,DM SO罐的平均糖耗速率（1.0 g·L-1·h-1）比對照罐（0.6 g·L-1·h-1）高。在發酵115 h左右,DM SO罐的糖耗速率出現最低值,只有0.29 g·L-1·h-1。這可能是因為發酵115 h左右,發酵液中營養物質大部分被消耗,導致部分菌體自溶,因而糖耗也相應降低。

2.3.2 DMSO對菌濃的影響（圖5）

圖5 DMSO對菌濃的影響Fig.5 Effect of DMSO on cell growth

從圖5可以看出,對照罐的菌濃在發酵68 h達到48%,DM SO罐的菌濃比對照稍低,為37%。隨著發酵不斷進行,由于補料、取樣等因素使得發酵后期對照罐的菌濃維持在60%左右,DM SO罐在55%左右。可見,流加0.16%的DM SO不會對紅色糖多孢菌產生大的毒性。

2.3.3 DMSO對紅霉素效價的影響（圖6）

圖6 DMSO對紅霉素效價的影響Fig.6 Effect of DMSO on chem ical titre of erythromycin

從圖6可以看出,對照罐和DM SO罐在發酵67 h的效價均為3000 U·m L-1左右;對照罐在發酵72 h后,效價增長緩慢,最終效價為7132 U·m L-1;DM 2 SO罐雖然在發酵72～100 h時,效價增長比對照罐緩慢,但在發酵100 h后增長明顯,最終效價達到7961 U·mL-1,比對照罐提高了11.6%。

2.3.4 DMSO對P450單加氧酶含量的影響（圖7）

圖7 DMSO對P450單加氧酶含量的影響Fig.7 Effect of DMSO on conten t of P450

從圖7可以看出,在發酵96 h時,對照罐的 P450單加氧酶含量達到最高值,此時是紅霉素合成的最佳時期;在整個發酵過程中,DM SO罐的P450單加氧酶含量基本上高于對照罐;發酵結束,DM SO罐的P450單加氧酶含量達0.825 nmol·mg-1,比對照罐（0.430 nmol·mg-1）提高了0.395 nmol·m g-1。由此推斷,DM SO是通過提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量來提高紅霉素的產量的。

2.4 討論

DM SO是具有一定毒性的物質,添加量過多,會導致紅霉素效價顯著下降,因此在合適的時間添加適量的DM SO才會在基本不影響菌體正常代謝的前提下提高紅霉素效價。本實驗未深入研究DM SO對菌體的負面影響,但因其毒性和化學性質,不可忽略可能帶來的潛在不良后果。

3 結論

分別研究了搖瓶發酵和15 L發酵罐中二甲基亞砜對紅霉素合成的影響。在紅色糖多孢菌發酵48 h時,向發酵罐培養基中流加體積分數為0.16%的二甲基亞砜,紅霉素效價可達7961 U·m L-1,比對照提高11.6%。研究DM SO作用機理發現,DM SO是通過提高羥基化酶——P450單加氧酶的含量來提高紅霉素的產量的。

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Study on Effects of DMSO on Synthesis of Erythromycin

D ING Pan2pan1,GAO Shu2hong1,CHEN Chang2hua1,YE Rui2fang1,W U Pei2,M A Chao2an2
（1.State Key L aboratory of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,
Shanghai200237,China;2.Henan Topfond Pharm aceutical Co.,L td.,Zhum ad ian463000,China）

The biosynthesisof erythrom ycin by addition of dimethyl sulfoxide（DM SO）into medium in shake flask or in 15 L bioreactor were studied.The suitable volume fraction and adding time of DM SO were deter2 mined through shake flask experiment,and the effects of DM SO on the synthetic metabolism of erythromycin w ere exp lo red in 15 L bio reacto r.The result showed that,in the 15 L bio reacto r,the chemical titre of erythro2 mycin achieved 7961 U·mL-1w hich was increased by 11.6%of the control w hen 0.16%（volume fraction）DM SO w as added into the medium at 48 h of fermentation ofSaccharopolyspora ery thraea.A dding DM SO could increase the content of P450,so that the yield of erythromycin was increased.

erythromycin;dimethyl sulfoxide（DMSO）;biosynthesis;P450

TQ 465.5 Q 93

A

1672-5425（2010）06-0069-04

2010-01-08

丁盼盼（1985-）,女,山東濟寧人,碩士研究生,研究方向：微生物發酵;通訊作者：高淑紅,講師。