芡實黃酮類物質的提取及抗氧化性研究

李成良 ，陳學好 ，李良俊 ，張奉民 ，齊斌 ，錢建亞

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225009；2.揚州大學園藝與植物保護學院；3.揚州大學測試中心；4.常熟理工學院食品與生物工程學院）

芡實（Euryale feroxSalisb），睡蓮科芡屬，一年生大型水生草本植物，原產中國和東南亞，廣泛生長于我國南方湖泊、池塘和灘地，是一種新興的特種水生植物[1，2]。

芡實主要以種仁（通稱芡米）供食用，其營養成分以淀粉為主，另含有蛋白質、維生素、鈣、磷、鐵、硫胺素、核黃素、尼克酸、抗壞血酸、黃酮、氨基酸和葡糖基甾醇類化合物等[3,4]。芡實不僅具有較高的營養價值，還具有養血安神、益腎固精、去濕健脾、止瀉止帶等藥用功效。《神農本草經》將芡實列為上品，記有“主治濕痹，腰脊酸痛，補中除暴疾，益精氣，強志，令耳目聰明，久服輕身不饑”。芡實味甘性平，入脾、腎、胃經，既能益腎，又能健脾，先天、后天之本皆齊備，能提高人體的免疫力，從而祛病強身，延年益壽，是平補之佳品[5,6]。對芡實保健功效和藥用價值的認識由來已久，但對其起作用的成分和機理的說明鮮見報道。本文以紫花蘇芡和紫花刺芡種仁為原料，研究黃酮類物質的提取條件及提取物的抗氧化性質，以期為芡實的科學利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為揚州大學水生蔬菜試驗基地種植的“紫花蘇芡”和“紫花刺芡”的成熟種仁。主要試劑蘆丁、DPPH為Sigma公司產品。

1.2 試驗方法

①水分測定 根據GB/T 12087-2008淀粉水分測定法進行。

②芡實總黃酮含量測定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[7～9]測定總黃酮含量。將去殼的芡實種子粉碎過孔徑1 mm篩。取2 g粉，加入80 mL 95%（V/V，下同）乙醇，80℃水浴加熱回流3 h，抽濾，所得濾液用95%乙醇定容至100 mL，根據標準曲線，結果以蘆丁含量表示。試驗重復3次，結果取平均值。

③直接加熱浸提法 a.料液比對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成5組并標記，分別稱取5.0 g芡實粉于 250 mL 錐形瓶中，加入 25，50，75，100，125 mL 95%乙醇，60℃浸泡2 h，過濾，清洗，然后用 95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗重復3次，結果取平均值。

b.溫度對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成五組并標記，分別稱取5.0 g芡實粉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，分別于50℃，60℃，70℃，80℃和90℃保溫2 h，過濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗重復3次，結果取平均值。

c.浸泡時間對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成5組并標記，分別稱取5.0 g芡實粉于250 mL錐形瓶中，加入 50 mL 95%乙醇，60℃浸泡 1，2，3，4，5 h，過濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗重復3次，結果取平均值。

④黃酮超聲波輔助浸提法 a.料液比對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成五組并標記，分別稱取5.00 g芡實于250 mL錐形瓶中，再向其中加入5，25，50，75，100 mL 95%乙醇，用 400 W 超聲波處理 10 min，過濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗重復3次，結果取平均值。

b.超聲波功率對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成5組并標記，分別稱取5.00 g芡實于250 mL錐形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分別用200，300，400，500，600 W 超聲波處理 10 min，過濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率[10～13]。試驗重復3次，結果取平均值。

c.超聲波處理時間對提取效果的影響。取15個錐形瓶，分成五組并標記，分別稱取5.00 g芡實于250 mL錐形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分別在400 W 超聲波處理 5，10，15，20，25 min，過濾，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，測220 nm處的吸光度，根據標準曲線換算成黃酮量，除以總黃酮量得提取率。試驗重復3次，結果取平均值。

⑤超聲波輔助提取條件優化 根據提取時間、料液比和超聲功率3個因素的單因素試驗結果，采用正交試驗進行提取條件優化。

⑥芡實黃酮提取液抗氧化性研究 a.清除DPPH能力的測定。對不同黃酮含量的受試物進行反應動力學測定，根據體系達到穩定時殘留的DPPH百分數對黃酮（以蘆丁為代表）與DPPH摩爾比作圖，得到自由基的清除能力（EC50），定義為使起始DPPH濃度降低50% 所需黃酮的量，其倒數（1/EC50）為抗自由基能力（ARP）。使用 A-300 EPR 波譜儀（Bruker,德國），諧振腔為HSC（ER 4119），頻率為X波段。將不同摩爾比的DPPH和提取物加入50 μL硼制毛細管，在諧振腔中用硅制吊環固定毛細管。操作溫度為20℃。5 min起，每間隔5 min記錄一次信號。DPPH的電子順磁波譜圖是五重峰，利用絕對值較大的第2個波峰為計算依據，以加入受試物前后波峰信號大小的比值衡量DPPH的清除能力[14,15]。

表1 超聲輔助黃酮提取因素及水平

b.對羥自由基的清除作用。樣品組試管中加入1 mL 2 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L 水 楊 酸 、1.2 mL不同濃度的芡實提取溶液、1 mL 6 mmol/L H2O2或1.2 mL蒸餾水，37℃恒溫水浴保溫一定時間后，取出冷卻，測定OD50，根據以下公式計算·OH的清除率[16,17]。

清除率（%）=1-（A1-A2）/A0

其中：A0為不含樣品時的吸光值

A1為含有樣品的吸光值

A2為含有樣品，但不含水楊酸和H2O2的吸光值

2 結果與分析

2.1 芡實種仁中的黃酮類物質和水分含量

紫花蘇芡的黃酮類物質含量為（1.864±0.029） mg/g，水分為（92.3±3.5）g/kg；紫花刺芡的黃酮類物質含量為（1.735±0.005） mg/g，水分為（77.3±1.7） g/kg。

2.2 芡實黃酮類物質的特征光譜

在200～780 nm的范圍內，芡實提取液的最大吸收峰出現在219.9 nm處（圖1，因可見光區無吸收，圖中只標示出紫外光區部分吸收光譜），這是黃酮物質常見的光吸收特征。

2.3 芡實種仁黃酮類物質加熱浸提效果

①料液比的影響 在其他條件一定的情況下，隨著料液比增加，芡實中黃酮的提取率增加（圖2）。在料液比為 1∶25（m/V）時，黃酮提取率最大，為 85.92%。

②提取溫度的影響 在其他條件一定的情況下，隨著溫度增加，黃酮的提取率呈增加趨勢（圖3），在80℃時獲得了最大提取率，提取率為82.29%。

表2 超聲輔助黃酮提取正交試驗設計及結果

③提取時間的影響 在其他條件一定的情況下，隨著提取時間增加，黃酮提取率總體呈上升趨勢（圖4），在4 h時獲得最大提取率83.43%。

圖5 料液比對提取效果的影響

圖6 時間對提取效果的影響

圖7 超聲功率對提取效果的影響

2.4 芡實黃酮超聲波輔助浸提效果

①料液比的影響 與上述純粹的加熱提取比較，超聲輔助提取時，隨著料液比增加，黃酮的提取率呈現增長趨勢，在料液比為1∶25（m/V）時獲得最大提取率88.86%（圖5）。

②提取時間的影響 很明顯，超聲輔助提取可大大縮短提取時間，在20 min時獲得最大提取率87.87%（圖6）。

③超聲功率的影響 在其他條件一定的情況下，超聲功率對黃酮的提取有較大影響，在500 W時獲得最大提取率（85.21%）（圖7）。

2.5 超聲波輔助浸提法的條件優化

在以上單因素試驗的基礎上，選擇提取時間、料液比和超聲功率3個因素，根據表1的試驗方案，對所得結果（表2）進行方差分析，結果（未列出）表明各因素對芡實中黃酮提取效果的影響依次為：提取時間 ＞料液比 ＞超聲功率，單個因素之間沒有顯著差異。最佳提取工藝為：提取時間20 min，功率：400 W，料液比：1∶20（m/v）。

2.6 芡實黃酮類物質的抗氧化作用

①清除DPPH的能力 以DPPH自由基剩余率為縱坐標，時間為橫坐標作圖，得到紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮清除DPPH自由基動力學（圖8），結果表明芡實類黃酮屬于慢反應動力學類型[18]。由圖9可見，芡實清除DPPH的能力與紫花刺芡相當，其EC50都約為0.075，故其 ARP 為 13.3。

②清除羥自由基的能力以羥自由基為縱坐標，時間為橫坐標作圖，得到紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮清除-OH自由基動力學（圖10）。圖11可以看出，紫花蘇芡對羥自由基的抑制能力明顯好于紫花刺芡，其半抑制濃度 IC50約為 9.4 mg/L。

3 討論

采用這2種提取方法的黃酮提取率沒有顯著差異，直接提取方法過程控制簡單，容易實施，但時間和溶劑的消耗較多。超聲輔助提取是越來越多使用的方法，省時快捷，但是否會破壞有效成分尚不清楚，工業化生產規模會受到設備大小制約。

圖8 類黃酮清除DPPH動力學

圖9 芡實提取液的EC50

DPPH是一種很穩定的氮中心的自由基。通過檢測某物質對DPPH自由基的清除能力可以評價其抗氧化性的強弱。羥自由基是氧化性極強的氧化劑，其化學性質非常活潑，是對機體為害最大的自由基，可損傷蛋白質、核酸、脂質等多種生物大分子，尤其對脂過氧化的作用最強，不僅是膜脂質過氧化的主要原因，而且還一直被認為是引起DNA損傷的重要因素。紫花蘇芡和紫花刺芡類黃酮提取物都具有清除DPPH和羥自由基的能力，但效果有差別。從DPPH的清除效果看，芡實黃酮具有很強的抗氧化功能。體外抗氧化試驗有多種體系，其結果有不同的含義，要綜合評價某種物質的抗氧化性能需經多種體系驗證。此外，本文得到的是混合物，進一步的工作可以對提取物進行分離，研究黃酮類化合物的組成和結構，從而弄清差別產生的原因。

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