大孔樹脂分離純化花生殼總黃酮的研究

張 斌 孫蘭萍 馬 龍 趙大慶 許 暉

(蚌埠學院食品與生物工程系1,蚌埠 233030)

(合肥工業大學生物與食品工程學院2,合肥 230009)

大孔樹脂分離純化花生殼總黃酮的研究

張 斌1,2孫蘭萍1馬 龍1趙大慶1許 暉1

(蚌埠學院食品與生物工程系1,蚌埠 233030)

(合肥工業大學生物與食品工程學院2,合肥 230009)

為了分離純化花生總殼黃酮,比較了 8種大孔樹脂的靜態吸附過程,篩選出了適合吸附花生殼總黃酮的樹脂。研究了花生殼總黃酮在大孔吸附樹脂上的動態吸附特性,并確定分離花生殼總黃酮的適宜工藝條件。結果表明:AB-8大孔樹脂對花生殼總黃酮有較好的吸附分離性能,其對花生殼總黃酮的靜態吸附平衡時間為 4 h;AB-8型大孔樹脂對花生殼總黃酮有較好的吸附和解吸效果;較優的吸附分離工藝參數為:樣液 pH值 6.0,上樣液流速 1 mL/min,上樣液質量濃度 0.5 mg/mL,用 70%乙醇洗脫時,解吸率達94.23%,3 BV洗脫液基本上能將花生殼總黃酮洗脫下來。

花生殼 總黃酮 大孔樹脂 分離純化

花生 (Arachis hypogaea L.)屬豆科一年生草本科植物,是我國重要經濟作物。花生殼是其莢果外殼,在加工過程中每年產生約 450萬 t,除了很少部分被用于飼料加工、食用菌栽培、化工原料或藥品生產等外,絕大部分都被當作燃料或廢棄物,資源利用率非常低,其資源開發尚有很大的潛力[1-2]。研究表明花生殼中除含有碳水化合物和粗纖維外,還含有黃酮類物質[3]。現代科學研究證明花生殼黃酮具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌癥、抗衰老、抑制高血壓高血脂及預防心血管疾病等多種藥理作用[4-5]。因此,對花生殼黃酮化合物的研究與利用越來越受到人們的重視,其在食品、醫藥、保健品和化妝品等領域也將具有廣闊的應用前景[6-7]。目前花生殼黃酮類物質主要采用水浸提,堿性水浸提和乙醇等溶劑法提取[8-9],粗提物中普遍存在黃酮物質含量較低、有機溶劑殘留等缺點,需進一步分離純化,以提高黃酮的純度。

大孔樹脂是 20世紀 60年代發展起來的一類新型高分子材料,90年代后其應用日趨廣泛。大孔樹脂是國家“十五”期間重點推廣的新技術,具有吸附容量大、吸附速度快、分離效果好、再生簡便等優點[10-14],廣泛應用于植物天然活性成分的分離和純化[13-15]。目前對花生殼有效成分的提取和分離純化缺乏系統研究,國內外文獻報道不多。在前期對花生殼總黃酮提取研究的基礎上[8,16],選擇 8種大孔樹脂,比較其對花生殼總黃酮的吸附量和解吸率,從中篩選出較優的大孔樹脂并對其動態吸附和解吸性能進行考察,以期為綜合利用花生殼資源,開發黃酮類制品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生殼:花生果產于安徽省,手工剝殼,粉碎后備用。蘆丁 (生化試劑,國藥集團化學試劑有限公司);大孔樹脂 (樹脂 LSA-10、LSA-21):西安深藍公司 ;樹脂 AB-8、S-8、DA-201、DM-301、HPD-100和 X-5:天津南開大學化工廠。8種大孔樹脂的物理性能見表 1。

表 1 大孔樹脂的物理性能

1.2 儀器

UV1102型紫外可見分光光度計:北京瑞利分析儀器公司;RE-52A旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠;BSZ-160自動部分收集器:上海青浦滬西儀器廠;HL-2恒流泵:上海青浦滬西儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生殼黃酮提取液的制備

將新鮮成熟的花生殼清洗,晾干,粉碎過 40目篩,稱取粉碎花生殼 200 g,置于 1 000 mL圓底燒瓶中,注入占燒瓶 1/2體積的乙醇,接上回流冷凝管,于水浴中加熱回流 3 h,過濾后殘渣再用 1 000 mL乙醇提取 2次,合并濾液,用旋轉蒸發器濃縮至無乙醇味,過濾得到花生殼總黃酮粗提液。

將樣品溶液稀釋至一定濃度,準確吸取 1 mL于25 mL容量瓶中,與標準曲線同法操作測定吸光度,帶入回歸方程計算樣品溶液總黃酮含量。

1.3.2 標準曲線和回歸方程的建立

采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[15]。準確稱取干至恒重的蘆丁標準品 0.020 g,用 60%乙醇溶解,定容于 100 mL容量瓶,得質量濃度為 0.20 mg/mL蘆丁標準液。準確吸取蘆丁標準溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 10 mL容量瓶中 ,加入 5%的 NaNO2溶液 0.3 mL還原 6 min,加入 10%的 Al(NO3)3溶液 0.3 mL絡合 6 min,加入質量分數為4%(即 1 mol/L)的 NaOH溶液 4 mL,最后用 30%乙醇定容,搖勻,顯色 15 min,在波長 510 nm處測定吸光度,計算得蘆丁溶液濃度 C(mg/mL)相對于吸光度A間的回歸方程為:A=11.589 0C+0.010 2,R2=0.998 1。

1.3.3 大孔樹脂的預處理

將新大孔樹脂用 95%的乙醇浸泡 24 h使其充分溶脹,然后用乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁現象,用蒸餾水除去乙醇;再用 5%鹽酸浸泡 12 h,除去破碎的顆粒,用 3 BV(柱床體積)的 5%HCl溶液以 5 BV/h的流速沖洗樹脂,用蒸餾水洗至中性;最后用 5%NaOH浸泡 12 h,除去破碎的顆粒,用3 BV的 5%NaOH溶液以 5 BV/h的流速沖洗樹脂,蒸餾水洗至 pH值為中性[15,17]。

1.3.4 靜態吸附解吸試驗[15,18]

1.3.4.1 吸附量的測定

準確稱取經預處理后抽干的 8種樹脂各 0.5 g裝入具塞磨口三角瓶中,分別加入一定濃度花生殼總黃酮水溶液 50 mL,于電動振蕩器中,在室溫下以100 r/min的頻率振蕩吸附 24 h,過濾,測定濾液中剩余花生殼總黃酮濃度,按式 (1)計算各種樹脂室溫下的吸附量。

式中:Q為吸附量/mg/g;C0為起始濃度,mg/mL;Ce為平衡濃度/mg/mL;V為加入樣品液體積 /mL;W為樹脂濕重 /g。

1.3.4.2 解吸率的測定

將吸附處理好的 8種樹脂置錐形瓶中,分別加入 95%乙醇 20 mL,于吸附相同的條件下振蕩 12 h,過濾,測定濾液中花生殼黃酮濃度,按式 (2)計算樹脂的解吸率。

式中:D為解吸率/%;Cx為解吸液中花生殼總黃酮濃度 /mg/mL;Vx為解吸液體積 /mL。

1.3.4.3 靜態吸附動力學特性的測定

在比較各樹脂的吸附量和解吸率的基礎上,選擇 2種較適合的樹脂測定其吸附速率。準確稱取濾紙吸干的大孔樹脂 0.5 g裝入具塞磨口三角瓶中,精密加入已知濃度的花生殼總黃酮水溶液 50 mL,置恒溫振蕩器上以 100 r/min的頻率振蕩,在 6 h內,每小時各取 0.5 mL,測定總黃酮含量,繪制靜態吸附動力學曲線。

1.3.4.4 上樣液 pH值選擇

準確稱取靜態試驗所篩選的樹脂 0.5 g于具塞磨口三角瓶中,分別加入不同 pH值的花生殼總黃酮水溶液 50 mL,其余同 1.3.4.1。

1.3.5 動態吸附 -洗脫工藝參數測定試驗

通過靜態吸附試驗,篩選出一種較優的樹脂,對其進行上樣液流速、濃度、洗脫劑濃度及解吸曲線等的考察[18]。將預處理好的樹脂裝入1.2 cm×20 cm色譜柱中,將花生殼總黃酮水溶液調 pH值至最佳范圍,然后上柱,控制一定流速,分步收集 (5 mL/管),當流出液的總黃酮濃度達泄漏點 (即達上樣液總黃酮濃度的 1/10)時,認為總黃酮已透過,停止上樣。

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂靜態吸附解吸試驗結果

2.1.1 不同大孔樹脂的吸附量和解吸率

由表 2可以看出,弱極性和極性樹脂的吸附能力較強,而非極性樹脂的吸附能力較差,這與花生殼黃酮具有的多酚結構和糖苷鍵結構有關,具有一定的極性和親水性,生成氫鍵的能力較強,有利于弱極性和極性樹脂對其吸附。此外,樹脂吸附能力還與孔徑、比表面積、孔容等物理結構參數有關。由表 2還可以看出,AB-8、LSA-10、S-8三種樹脂的吸附量都較大,其中 S-8樹脂吸附量較大,但解吸率太低,說明樹脂與花生殼黃酮結合能力較強,不利于后續黃酮類物質的解吸;綜合比較,AB-8、LSA-10對花生殼總黃酮的吸附量和解吸率都較高,所以 AB-8、LSA-10是較適用于花生殼總黃酮吸附分離的大孔樹脂類型。

表 2 不同樹脂的吸附量與解吸率

2.1.2 大孔樹脂的靜態吸附動力學特性

選擇較為合適的 AB-8、LSA-10樹脂進行靜態吸附動力學試驗,其靜態吸附動力學曲線如圖 1所示。

圖 1 大孔樹脂的靜態吸附動力學曲線

從靜態吸附動力學曲線可以看到,AB-8和LSA-10樹脂對花生殼總黃酮的吸附隨時間延長而吸附效果明顯增強,花生殼總黃酮在這2種樹脂上的動力學過程基本相似,但在吸附量上有一定差別;由圖 1同時可以看出,2種樹脂對花生殼總黃酮的吸附為快速平衡型,即起始階段吸附量都較大,到 4 h后,吸附量變化平穩,其靜態吸附基本達到平衡。但從總體上來看,AB-8樹脂的吸附量優于 LSA-10樹脂。

2.1.3 上液樣 pH值的影響

選擇 AB-8大孔樹脂,考察花生殼總黃酮水溶液 pH值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0時對吸附性能的影響,結果如圖 2所示。可以看出,一定的酸性條件有利于花生殼黃酮的吸附,其原因可能是當pH值較小時,溶液中黃酮類物質的糖苷鍵容易水解,影響樹脂對它們的吸附;隨著 pH值增大,黃酮類化合物在酸性條件下以分子狀態存在,主要以范德華力與樹脂進行物理吸附;而在堿性條件下,以離子狀態存在,不易與樹脂發生物理吸附作用,因此確定吸附 pH值 6.0為宜。

圖 2 pH值對吸附特性的影響

2.2 大孔樹脂動態吸附 -洗脫工藝參數優化

2.2.1 上液樣流速的影響

花生殼總黃酮水溶液質量濃度為 0.5 mg/mL,溫度 20℃,pH值 6.0,分別控制柱流速為 0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min,每 10 mL收集流出液,測定流出液中花生殼總黃酮的質量濃度,繪制動態動力學曲線,如圖 3所示,研究流速對樹脂吸附動態動力學曲線的影響,確定合適的操作流速。

圖 3 不同流速下總黃酮在AB-8樹脂上的動態吸附曲線

由圖 3可以看出,吸附流速為 0.5 mL/min和1.0 mL/min時泄漏點出現較晚,在 180 mL附近,其原因可能是流速較慢時花生殼總黃酮與樹脂接觸的時間較長,有利于其從液相擴散到樹脂內部,從而提高了吸附率。隨著流速增大到 2.0 mL/min,漏出點出現較早,大約在 140 mL附近,可能是由于流速過快,花生殼總黃酮來不及被樹脂吸附就隨滲透液流出,因此流速慢有利于吸附,但流速過慢,導致生產周期長,吸附效率低,不利于工業化生產。綜合考慮,選擇流速為 1 mL/min為較佳吸附流速。

2.2.2 上樣液質量濃度的影響

流速 1.0 mL/min,溫度 20℃,pH 6.0,上樣液黃酮質量濃度分別為 0.3、0.5、0.7 mg/mL,測定吸附后流出液中花生殼總黃酮的質量濃度,繪制動態動力學曲線,如圖 4所示,研究花生殼總黃酮質量濃度對樹脂吸附動態動力學曲線的影響。

圖 4 不同樣液濃度下總黃酮在AB-8樹脂上的動態吸附曲線

由圖 4可以看出,當花生殼總黃酮質量濃度為0.3 mg/mL和 0.5 mg/mL時,吸附動態動力學曲線比較靠近,在一定范圍內,吸附量隨花生殼總黃酮質量濃度的增大而增大,但隨黃酮質量濃度繼續增大,傳質速度變慢,且樹脂周圍的黃酮分子過多,使得部分黃酮沒來得及被吸附就流出來,且泄漏提前,樹脂的吸附量降低。在實際工作中,選擇合適的花生殼總黃酮濃度將有利于提高 AB-8大孔樹脂的吸附性能。因此,上樣質量濃度確定為 0.5 mg/mL。

2.2.3 洗脫劑體積分數的影響

將吸附花生殼總黃酮飽和了的樹脂 0.5 g裝入三角瓶中,分別加入 30%、40%、50%、70%和 95%乙醇 20 mL,置于恒溫搖床中振搖 24 h后,測定各解吸液中總黃酮量,計算解吸率,結果如圖 5所示。可以看出,隨著乙醇體積分數增加,樹脂吸附的黃酮脫附量開始迅速增加,到乙醇體積分數 60%后,增加幅度緩慢,當乙醇體積分數 70%時,解吸率達到 94.23%,繼續提高乙醇體積分數,黃酮解吸率反而減小,可能是乙醇體積分數大于 70%后,其他雜質容易一起洗脫下來影響解吸液中黃酮化合物的含量,因此選用 70%乙醇洗脫黃酮。

圖 5 洗脫劑體積分數對解吸率的影響

2.2.4 動態解吸曲線

吸附飽和的 AB-8樹脂,采用 3 BV 70%的乙醇洗脫,洗脫速度 1.0 mL/min,收集流出液 (5 mL/管),分別測定總黃酮濃度,結果見圖 6。

圖 6 動態解吸曲線

由圖 6可以看出,動態條件下 AB-8樹脂上吸附的花生殼總黃酮極易洗脫,只用很少量的洗脫劑即可使樹脂柱上吸附的總黃酮洗脫下來。采用 70%的乙醇解吸時,洗脫峰集中,對稱性好,無拖尾現象,3 BV 70%乙醇基本上可將花生殼總黃酮洗脫下來。

3 結論

3.1 通過對 8種大孔樹脂的靜態吸附研究,發現AB-8型大孔樹脂是一種比較理想的樹脂,吸附率大,解吸率高,較適合花生殼總黃酮的分離純化。

3.2 當上液樣 pH值為 6.0,上樣液質量濃度為 0.5 mg/mL,上樣流速為 1 mL/min時,AB-8樹脂對花生殼總黃酮的吸附量為 9 mg/mL。

3.3 當用 70%的乙醇作為花生殼總黃酮的洗脫劑時,解吸率達 94.23%,且洗脫峰集中,對稱性好,無拖尾現象,用 3BV的 70%乙醇基本上能將花生殼總黃酮洗脫下來。

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Separation and Purification of Flavonoids from Peanut Hull byMacroporous Resins

Zhang Bin1,2Sun Lanping1Ma Long1Zhao Daqing1Xu Hui1
(Department of Food and Bioengineering,Bengbu College1,Bengbu 233030)
(School ofBiotechnology and Food Engineering;HefeiUniversity of Technology2,Heifei 230009)

In order to separate and purify flavones from peanut hull,the static adsorption behaviors of eight kinds ofmacroporous resin for peanut hull flavonoids(PHF)were studied and the optimum macroporous resin was screened in the presentwork.Additionally,the adsorption performance of the propermacroporous resin for PHF was researched and the optimum parametersof the adsorptionwere procured.Results:AB-8 macroporous resin is select2 ed as the optimum macroporous resin to extract and separate PHF under the experi mental condition,and the adsorp2 tion equilibrium ti me ofAB-8 for PHF is 4 h.The opti mum technological parameters of the adsorption and separa2 tion are pH 6.0,velocity of flow 1 mL/min and sample solution concentration 0.5 mg/mL.When 70%ethanol is used as eluant,the desorption capacity is 94.23%,and eluant 3 BV can desorb PHF basically.

peanut hull,flavonoids,macroporous adsorption resins,separation and purification

TS201

A

1003-0174(2010)02-0126-05

安徽高校省級自然科學研究資助項目(KJ2007B051),蚌埠學院中青年學科帶頭人培養對象資助項目 (院人字[2006]18號)

2009-03-01

張斌,男,1975年出生,講師,農產品加工與貯藏

許暉,男,1969年出生,副教授,食品科學及食品生物技術