膜聯蛋白A1和增殖細胞核抗原在胰腺癌組織中的表達及其相互關系

倪曉光 白曉楓 王貴齊 劉尚梅 郭冰 趙平

·論著·

膜聯蛋白A1和增殖細胞核抗原在胰腺癌組織中的表達及其相互關系

倪曉光 白曉楓 王貴齊 劉尚梅 郭冰 趙平

目的研究膜聯蛋白A1(annexin A1，ANXA1)在胰腺癌中的表達及其與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的相關性。方法應用組織芯片制作儀構建芯片，芯片上有39例正常胰腺組織，42例胰腺癌組織，7例胰島細胞瘤組織，8例壺腹腺癌組織。在連續的芯片切片上使用免疫組化法檢測ANXA1和PCNA蛋白的表達，分析兩者的相關性。結果構建的組織芯片在免疫組化染色后的掉片率為11.7%～13.3%，滿足實驗要求。ANXA1在胰腺癌中的陽性表達率為71.4%(30/42)，明顯高于正常胰腺組織18.4%(7/38)的陽性率(P<0.01)。PCNA在胰腺癌中的陽性表達率為73.8%(31/42)，也明顯高于正常胰腺組織22.2%(8/36)的陽性率(P<0.01)。胰腺癌組織ANXA1表達與PCNA表達顯著相關(P<0.01)。結論胰腺癌ANXA1蛋白的表達與PCNA表達同步增加。

胰腺腫瘤； 膜聯蛋白A1； 增殖細胞核抗原； 組織芯片

使用基因組學和蛋白質組學等高通量技術手段篩選出一些在胰腺癌與正常胰腺組織之間差異表達的分子，不僅有助于認識胰腺癌變的分子機制，更有助于發掘新的胰腺癌診斷標志物及治療靶標。膜聯蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是我們前期發現的一個在胰腺癌中表達明顯增強的蛋白質[1]，本研究采用免疫組化方法檢測ANXA1與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在胰腺癌中的表達，探討ANXA1在胰腺癌發病中的分子機制。

材料和方法

一、標本來源和臨床資料

收集中國醫學科學院腫瘤醫院及牡丹江市結核腫瘤醫院1990年1月至2002年8月的存檔蠟塊標本57例，其中男37例，女20例，年齡19～71歲，中位年齡60歲。將蠟塊標本切片，由高年資病理醫師重新進行診斷。最后確診胰腺導管腺癌32例，其中高分化4例，中分化17例，低分化11例；胰腺黏液腺癌6例；胰腺腺泡細胞癌4例；胰島細胞瘤7例；壺腹部腺癌8例。所有病例術前均未接受放、化療。

二、組織芯片的構建

根據HE染色結果，在對應的供體蠟塊上標記出含有所需要的腫瘤或正常胰腺組織(39例)的目標區域，應用組織芯片制作儀(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)，用直徑0.6 mm的空心細針從供體蠟塊吸取組織，按預先設計好的排列方式安放在已打好孔的受體蠟塊的適當位置。完成排列后，將組織陣列石蠟塊以5 μm厚度連續切片，貼敷于載玻片，56℃烤片5 h以上。切片做常規HE染色，驗證組織芯片是否與設計相符。

三、ANXA1和PCNA蛋白檢測

采用免疫組化SP染色法，試劑盒購自福建邁新公司。小鼠抗人ANXA1單抗(美國BD Biosciences Pharmingen)1∶100稀釋，PCNA單抗(中山生物技術有限公司)1∶150稀釋。以已知陽性組織切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。結果判定[2]：按陽性區域染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽性細胞所占比例評分，<1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩分值相乘，>3分為陽性。

四、統計學分析

應用SPSS11.5軟件包進行統計分析。免疫組化結果采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關性檢驗，以P<0.05為差異具有顯著性。

結 果

一、組織芯片的構建

芯片上有39例正常胰腺組織，42例胰腺癌組織，7例胰島細胞瘤組織，8例壺腹腺癌組織，每例取2～3個組織點，共排列了256個點。切片經HE染色后，組織學可觀測率為95.3%(244/256)。ANXA1免疫組化染色，切片的組織掉片或皺折率為13.3%(34/256)，其中1例正常胰腺和1例壺腹腺癌組織的所有組織點均脫片；PCNA免疫組化染色，切片的組織掉片或皺折率為11.7%(30/256)，其中3例正常胰腺和1例壺腹腺癌組織的所有組織點均脫片。

二、ANXA1和PCNA蛋白表達

正常胰腺組織中，少數散在的腺泡和導管細胞的胞質和細胞核可見ANXA1的表達(圖1a)，陽性率為18.4%(7/38)。胰腺癌細胞的胞質和細胞膜可見ANXA1表達(圖1b)，陽性率為71.4%(30/42)，其中導管腺癌、黏液腺癌、腺泡細胞癌的ANXA1陽性表達率分別為75.0%(24/32)、83.3%(5/6)、25.0%(1/4)；胰島細胞瘤和壺腹腺癌的陽性率均為57.1%(4/7)。各類腫瘤的陽性率均明顯高于正常胰腺組織(P<0.01)，但各類腫瘤間無顯著差異。

正常胰腺組織中，少量腺泡細胞的細胞核中有PCNA表達(圖1c)，陽性率為22.2%(8/36)。胰腺癌細胞的胞核中有PCNA表達(圖1d)，陽性率為73.8%(31/42)，其中導管腺癌、黏液腺癌、腺泡細胞癌的PCNC陽性率分別為81.2%(26/32)、66.7%(4/6)、25.0%(1/4)；胰島細胞瘤和壺腹腺癌的陽性表達率分別為42.9%(3/7)和71.4%(5/7)。各類腫瘤的陽性率均顯著高于正常胰腺組織(P<0.01)，但各類腫瘤間無顯著差異。

三、胰腺癌中ANXA1與PCNA表達的相關性

在2張連續的切片上分別行ANXA1和PCNA免疫組化染色(圖2)。42例胰腺癌中，ANXA1與PCNA同時陽性表達25例(59.5%)，同時陰性表達6例(14.3%)，存在顯著的相關性(P<0.01)。其中11例低分化胰腺導管腺癌中9例同時陽性表達，8例轉移性胰腺導管腺癌中6例同時陽性表達。

圖1正常胰腺、胰腺癌組織中ANXA1(a、b)和PCNC(c、d)的表達(免疫組化 ×400)

圖2同一病例連續胰腺癌組織芯片切片的ANXA1(a)和PCNA(b)的表達 (免疫組化 ×100)

討 論

組織芯片是將數十、數百乃至上千個不同個體的組織標本按預先設計的順序排列在某一載體上而組成的微縮組織切片。使用組織芯片可以在嚴格、均一的實驗條件下，快速、平行地檢測大批量組織樣本中的一個或多個實驗指標，明顯地提高了研究效率，同時使實驗結果更具可比性。本文構建的胰腺癌組織芯片，免疫組化染色后的掉片率僅11.7%～13.3%，能滿足研究的要求。

Annexins家族是一組結構相似的蛋白質，含有高度保守的4或8個重復序列組成的C-末端，構成其核心結構域，表現出與鈣和磷脂結合的特性。其N-末端結構域在長度和序列的差異使Annexins家族成員表現出不同的生物活性，包括信號轉導、DNA

復制、細胞轉化、離子通道形成和細胞凋亡等[3]。ANXA1是其家族中研究比較深入的一個成員，具有糖皮質激素樣作用，參與抑制細胞增殖、對抗炎癥反應、調節細胞分化以及調節下丘腦-垂體軸等過程[4]。ANXA1在人惡性腫瘤如鼻咽癌、宮頸癌、前列腺癌、食管鱗狀細胞癌和頭頸鱗狀細胞癌中表達降低，在結腸癌、食管和胃交界處的腺癌、腎透明細胞癌、肺癌、垂體瘤、肝癌、毛細胞白血病和腦惡性膠質瘤中表達升高，而在乳腺癌中有高表達和低表達兩種相反的報道[5]。本組結果顯示，ANXA1蛋白在胰腺癌中高表達。

PCNA是一種在細胞周期調控中發揮重要功能的核蛋白，在DNA合成的G1期開始增加，S期達高峰，G2/M期明顯下降[6]。本研究結果顯示，胰腺癌組織中PCNA陽性表達率明顯高于正常胰腺組織，與時開網等[7]的研究結果一致。本研究還顯示，胰腺癌組織ANXA1與PCNA的表達存在明顯的正相關，尤其在低分化和轉移性胰腺導管腺癌中，提示增殖能力強和惡性程度高的胰腺癌細胞中ANXA1的表達明顯增強。因此ANXA1可能是促進胰腺癌進展的一個重要分子標記，值得進一步深入研究。

[1] Bai XF,Ni XG,Zhao P,et al.Overexpression of annexin 1 in pancreatic cancer and its clinical significance.World J Gastroenterol,2004,10:1466-1470.

[2] Friedrichs K,Gluba S,Eidtmann H,et al.Overexpression of p53 and prognosis in breast cancer.Cancer,1993,72:3641-3647.

[3] Moss SE,Morgan RO.The annexins.Genome Biol,2004,5:219.

[4] Perretti M,D′Acquisto F.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation.Nat Rev Immunol,2009,9:62-70.

[5] 倪曉光，趙平，王貴齊.膜聯蛋白A1的結構和功能及其與惡性腫瘤的關系.癌癥進展,2010,8:63-66.

[6] Naryzhny SN.Proliferating cell nuclear antigen:a proteomics view.Cell Mol Life Sci,2008,65:3789-3808.

[7] 時開網,席鵬程,吳文瀾.胰腺癌組織中VEGF、PCNA與血管生成的關系及預后相關性.胰腺病學,2006,6:95-97.

2009-10-12)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofannexinA1andPCNAinpancreaticcancerandtheircorrelation

NIXiao-guang,BAIXiao-feng,WANGGui-qi,LIUShang-mei,GUOBing,ZHAOPing.

DepartmentofEndoscopy,CancerInstitute&Hospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021,China

ZHAOPing,Email:nixiaoguang@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of the annexin A1 (ANXA1) in pancreatic cancer and the correlations with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).MethodsTissue microarray instrument was used to construct the chip. There were 39 samples of normal pancreas tissue, 42 samples of pancreatic cancer, 7 samples of islet cell tumor and 8 samples of ampullary carcinoma. The expressions of ANXA1 and PCNA protein were examined by immunohistochemistry and their correlation was analyzed.ResultsThe off-chip rate of tissue chips after immunohistochemistry was 11.7%～13.3%, which could satisfy the needs for experiment. Immunohistochemical results of pancreatic cancer tissue microarray showed that the positive rate of ANXA1 expression in pancreatic cancer was 71.4% (30/42), which was significantly higher when compared with that of normal pancreas tissue (18.4%, 7/38;P<0.01). The positive rate of PCNA expression in pancreatic cancer was 73.8% (31/42), which was significantly higher than that of normal pancreas tissue (22.2%, 8/36;P<0.01). The expression of ANXA1 had a significant correlation with PCNA in pancreatic cancer (P<0.01).ConclusionsThe expression of ANXA1 protein was significantly increased in pancreatic cancer. The expression of ANXA1 was significantly correlated with the expression of PCNA.

Pancreatic neoplasms; Annexin A1; Proliferating cell nuclear antigen; Tissue microarray

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.007

北京市自然科學基金資助項目(7082057)，北京市科技新星計劃(2007A105)

100021 北京，中國醫學科學院腫瘤醫院內鏡科(倪曉光、王貴齊)，腹部外科(白曉楓、趙平)，病理科(劉尚梅)；牡丹江市第一人民醫院頭頸乳腺外科(郭冰)

趙平，Email：nixiaoguang@yahoo.com.cn