吡格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺PPARγ mRNA表達的影響

徐萍 李清華 王靜 徐凱 姜景平 陳令全

·論著·

吡格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺PPARγ mRNA表達的影響

徐萍 李清華 王靜 徐凱 姜景平 陳令全

目的觀察過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ)激動劑吡格列酮對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠PPARγ mRNA表達的影響。方法54只SD大鼠按完全隨機法分成假手術組、ANP組、吡格列酮組。采用牛磺膽酸鈉逆行胰膽管內注射建立ANP模型，于造模后3、6、12 h檢測血清淀粉酶含量，觀察胰腺病理學改變，并采用RT-PCR法檢測胰腺組織PPARγ mRNA的表達。結果ANP組6 h點的血清淀粉酶及胰腺組織病理學評分分別為(7171±1636)U/L和13.00±2.36，均較假手術組的(523±166)U/L和1.67±2.34顯著增高(P<0.01)，而PPARγ mRNA在兩組中表達均較弱，無顯著差異(0.18±0.05對0.22±0.03，P>0.05)；吡格列酮組6 h的血清淀粉酶水平、胰腺病理學評分分別為(4504±1901)U/L和9.00±0.89，均較ANP組明顯下降(P<0.05)，PPARγ mRNA表達較ANP組增強(0.56±0.05對0.18±0.05，P<0.05)。結論吡格列酮對ANP大鼠的保護作用可能與上調PPARγ基因的表達密切相關。

胰腺炎，急性壞死性； 過氧化物酶體激活物受體； 吡格列酮

過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ)是一類由配體激活的核轉錄因子，主要參與細胞的增殖、分化以及糖脂代謝的平衡。近年來研究發現，PPARγ激動劑能夠明顯抑制炎癥反應，然而其對重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的作用機制仍不十分清楚。因此，本文觀察PPARγ激動劑吡格列酮對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠PPARγ mRNA表達的影響，探討其抗炎機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠54只，清潔級，鼠齡2～2.5個月，體重160～200 g，由南昌大學醫學院動科部提供。按完全隨機法分為假手術組、ANP組和吡格列酮組，各18只。以胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液1 ml/kg體重(Sigma公司)制備ANP模型；吡格列酮組在制模前2 h腹腔注射吡格列酮50 mg/kg體重(成都宇洋高科技發展公司)；假手術組開腹后以鈍器輕劃胰腺3次。術后3、6、12 h腹主動脈取血，分離取血清；留取胰腺組織，部分于10%中性甲醛固定，部分置液氮罐保存。

二、指標的測定

1．血清淀粉酶：采用全自動生化分析儀檢測。

2．胰腺組織病理學檢查：胰腺固定標本采用常規病理學檢查，并按照Schmidt等[1]標準評分。

3．胰腺組織PPARγmRNA表達檢測：采用RT-PCR法。應用Trizol(Promega公司)抽提總RNA。PPARγ(642 bp)上游引物5′-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3′，下游引物5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3′；β-actin (228 bp)上游引物5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。引物由上海杰瑞基因技術公司合成。PCR條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、53℃(PPARγ)或55℃(β-actin)1 min、72℃ 1 min，29個循環，72℃ 5 min。產物經電泳分離，圖像分析軟件掃描，以PPARγ/β-actin比值表示mRNA 相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶的變化

ANP組血清淀粉酶活性于術后3 h急劇上升，6 h達峰值，顯著高于假手術組(P<0.01)；吡格列酮組血清淀粉酶含量較ANP組同時點均降低，其中6、12 h降低顯著(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺組織病理學改變

假手術組大鼠胰腺組織結構清晰，腺泡小葉完整，偶見間質區輕度水腫(圖1a)；ANP組胰腺水腫，部分腺泡呈孤島狀，伴大片腺泡細胞壞死，胰腺實質及間質內見大量紅細胞、炎癥細胞浸潤(圖1b)，病理評分較假手術組明顯升高(P<0.01)；吡格列酮組鏡下表現較ANP組減輕(圖1c)，6、12 h的病理評分較ANP組明顯降低(P<0.05，表1)。

表1 各組血清淀粉酶及胰腺病理評分的變化

注：與假手術組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.05

圖1假手術組(a)、ANP組(b)和吡格列酮組(c)12 h的胰腺病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織PPARγ mRNA表達的變化

假手術組和ANP組PPARγ mRNA表達均較弱，兩組無明顯差異(P>0.05)；吡格列酮組PPARγ mRNA表達較假手術組及ANP組均明顯增強(P值均<0.05，表2、圖2)。

1：假手術組；2：ANP組；3～5：吡格列酮組(3、6、12 h組)

組別只數術后3h6h12h假手術組60.23±0.040.22±0.030.20±0.04ANP組60.21±0.030.18±0.050.15±0.03吡格列酮組60.40±0.03ab0.56±0.05ab0.65±0.04ab

注：與假手術組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

討 論

PPAR有三種表型：PPARα、PPARβ、PPARγ，其中PPAR-γ的研究最為深入。PPARγ激動劑可抑制NF-κB、AP-1等信號的活化，降低促炎因子、黏附分子表達以及環氧合酶、一氧化氮合酶、基質金屬蛋白酶-9的活性，負性調節炎癥反應[2-3]。目前認為，PPARγ激動劑可能通過PPARγ依賴和非依賴性途徑，從不同水平調控細胞內多條涉及炎癥反應的信號通路，實現抗炎作用。PPARγ依賴性機制可能包括：(1)直接與NF-κBp65/p50結合形成復合物，降低NF-κB的DNA結合活性，抑制下游靶基因的表達；(2)競爭性結合NF-κB、AP-1的輔助活化因子，阻止這些轉錄因子的激活；(3)抑制IκB激酶，阻止IκB的降解；(4)降低JNK活性，減少AP-1的活化[4-5]。PPARγ非依賴性途徑目前不太清楚。

近年來，PPARγ激動劑已被廣泛應用于急性胰腺炎(AP)的實驗研究，它對AP的保護作用得到不斷地驗證，有望成為一種治療AP的嶄新手段。Cuzzocrea等[6]采用羅格列酮干預雨蛙素誘導的AP小鼠，其胰腺組織中性粒細胞的浸潤、ICAM-1和硝基酪氨酸的表達均較AP組顯著下降。Hashimoto等[7]報道，PPARγ天然激動劑-15d-PGJ2可明顯減輕AP大鼠的胰腺組織損傷，減少IL-6的釋放及COX-2的表達，并抑制IκB蛋白的降解。Konturek等[8]研究顯示，吡格列酮對AP的抗炎作用呈劑量依賴性，并可促進熱休克蛋白-70的表達。我們前期實驗結果亦證實，吡格列酮能有效減輕ANP大鼠胰腺組織病理損傷，降低胰腺NF-κBp65/p50和ICAM-1蛋白的表達[9]。

然而，PPARγ激動劑在AP中的作用機制至今尚未完全闡明。有研究者發現，AP可導致胰腺組織中PPARγ蛋白表達下降，而15d-PGJ2能促進PPARγ蛋白表達，認為PPARγ激動劑表現出的抗炎特性有賴于PPARγ的參與[10]。有研究顯示，炎癥因子TNF-α、IL-1β可抑制PPARγ mRNA表達，而應用PPARγ激動劑則可使PPARγ 基因的轉錄恢復到正常水平，從而發揮調控炎癥反應的生物學效應[11]。本實驗結果顯示,大鼠ANP胰腺組織中PPARγ mRNA的表達略下降，應用吡格列酮干預后則可明顯增強PPARγ mRNA的表達，同時血清淀粉酶含量與胰腺組織學評分顯著降低。因此，我們推測吡格列酮可能是通過上調PPARγ基因表達而發揮對胰腺炎的保護性作用。

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[11] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflammatory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130.

2010-02-08)

(本文編輯：屠振興)

EffectofpioglitazoneonPPARγmRNAexpressioninratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUPing,LIQing-hua,WANGJing,XUKai,JIANGJing-ping,CHENLing-quan.

DepartmentofGastroenterology,SongjiangHospital,MedicalShchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China

XUPing,Email:yfyxp@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the effect of pioglitazone on peroxisome proliferators activated receptors (PPARγ) mRNA expression in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods54 rats were randomly divided into sham group, ANP group, and pioglitazone group. ANP was induced by the retrograde injection of sodium taurocholate into pancreatic duct. The levels of serum amylase at 3 h, 6 h, and 12 h after ANP induction were determined and pancreatic pathological scores were measured, and the expression of pancreatic PPARγ mRNA was determined by RT-PCR.ResultsThe levels of serum amylase and pancreatic pathological scores at 6 h in ANP group were (7171±1636)U/L and 13.00±2.36; which were significantly higher than those in sham group [(523±166)U/L and 1.67±234,P<0.01]. While the expressions of PPARγ mRNA were weakly expressed in ANP gyoup and sharm group(0.18±0.05vs0.22±0.03,P>0.05). The levels of serum amylase and pancreatic pathological scores at 6 h in pioglitazone group were (4504±1901)U/L and 9.00±0.89, which were significantly lower than those in ANP group (P<0.05). While the expressions of PPARγ mRNA was higher than that in ANP group (0.56±0.05vs0.18±0.05,P<0.05).ConclusionsThe protective role of pioglitazone on ANP rats was closely correlated with up-regulation of PPARγ gene expression.

Pancreatitis, acute necrotizing; Peroxisome proliferator-activated receptors; Pioglitazone

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.016

201600 上海，上海交通大學附屬上海市第一人民醫院松江分院消化內科

徐萍，Email：yfyxp@yahoo.com.cn