胰腺細針穿刺活檢組織K-ras突變檢測的診斷價值

王小瑋 高軍 任艷 顧俊駿 金震東 杜奕奇 湛先保 陳潔 黃浩杰 李兆申

·論著·

胰腺細針穿刺活檢組織K-ras突變檢測的診斷價值

王小瑋 高軍 任艷 顧俊駿 金震東 杜奕奇 湛先保 陳潔 黃浩杰 李兆申

目的檢測內鏡超聲引導下細針穿刺穿刺物中K-ras基因的突變，探討其對胰腺癌早期診斷的價值。方法收集27例胰腺癌、9例其他惡性腫瘤及14例良性胰腺占位患者的細針穿刺物，應用肽核酸(PNA)鉗制PCR法檢測K-ras突變。結果胰腺癌患者K-ras突變陽性率為88.9%，其他惡性腫瘤為44.4%，良性胰腺占位為35.7%，胰腺癌與其他兩種病變差異顯著(P=0.013，P=0.001)。胰腺癌與其他惡性腫瘤比較，K-ras基因突變的敏感性、特異性、陽性預測率、陰性預測率、準確率分別為88.9%、55.6%、85.7%、62.5%、80.6%，差異顯著(P=0.013)；與良性胰腺占位病變比較，分別為88.9%、64.3%、82.8%、75.0%、80.5%，差異亦顯著(P=0.001)。聯合穿刺物細胞學檢查和K-ras基因突變檢測，胰腺癌的陽性率高達96.3%。結論胰腺組織穿刺物的K-ras基因突變檢測可提高胰腺癌診斷的陽性率。

胰腺腫瘤； K-ras基因； 肽核酸類； 基因診斷

超聲內鏡引導下細針穿刺術(EUS-FNA)可簡單、安全地獲得胰腺組織的細胞標本。但由于不易操作等多個因素，使EUS-FNA對胰腺癌診斷的敏感性、特異性及準確性存在較大差異[1-2]。 K-ras基因突變與胰腺癌的發生、發展密切相關[3]，在手術切除的胰腺癌組織中突變率可達95%[4]，且幾乎都集中于第1外顯子的12密碼子，以CGT、GTT和GAT三種突變類型最為常見[5]。本文建立一種新的K-ras基因突變的肽核酸(PNA)鉗制PCR檢測方法，提高了檢測靈敏度，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2008年9月至2009年6月對胰腺及鄰近臟器占位性病變進行EUS-FNA檢查的50例患者，其中男26例，女24例，平均年齡59歲。所有患者均檢測血CA19-9和CEA，并行其他影像學檢查。最后確診胰腺癌27例，其他惡性腫瘤9例(肝癌1例，惡性胃間質瘤3例，后腹膜腺癌2例，壺腹癌3例)，良性胰腺占位14例(導管內乳頭狀黏液性腫瘤5例，胰腺囊腺瘤3例，非慢性胰腺炎的炎性改變4例，慢性胰腺炎2例)。

二、 FNA標本的收集及DNA的抽提

EUS-FNA由專職醫師完成。當EUS在胃內清楚顯示病灶后，按與病灶最近的距離確定穿刺路徑。用探頭靠近并緊壓病灶相對應的胃壁，經活檢鉗道插入穿刺套針，用19G或22G穿刺針刺破胃壁至病灶內，在10 ml注射器負壓下對腫塊來回抽吸5～10次。細針穿刺所得大部分組織置于10%多聚甲醛中固定，常規行病理檢查，剩余組織置液氮中保存備用。未能獲得組織時，用0.5～1 ml的生理鹽水將穿刺物沖入20 ml的液積溶液(安必平，中國)，混勻后取5 ml，離心，沉淀置-80℃冰箱凍存備用。剩余液積溶液離心，取沉淀涂片行細胞學檢查。術后給予患者口服抗生素，無1例出現穿刺并發癥。

采用QIAamp DNA Micro Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)抽提凍存組織或液積沉淀細胞的DNA。應用分光光度計測A260和A280值，計算DNA濃度，-20℃冰箱中凍存備用。

三、K-ras基因突變檢測

采用肽核酸鉗制(PNA)PCR方法。由韓國PNAGENE公司設計、合成與野生型K-ras基因12、13密碼子完全匹配的PNA。根據人K-ras基因序列用Primer5.0軟件自行設計引物序列，P1:ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA，P2：CCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTC， P3：TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC，由Invitrogen公司合成。第一輪行鉗制PCR，反應體系中含引物P1、P3和PNA。擴增條件：95℃ 3 min，94℃ 20 s、70℃PNA結合15 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，40個循環，最后72℃ 5 min。取第一輪產物作為模板進行第二輪PCR，反應體系中含引物P3和P2。擴增條件：95℃ 3 min，94℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s， 35個循環，最后72℃ 5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、自動成像系統攝影。并將擴增條帶送Invitrogen公司測序。

四、統計學方法

采用統計軟件SPSS16.0進行數據分析，采用Fisher′s Exact Test方法檢驗各自率之間的差異，顯著性差異水準為P<0.05。

結 果

一、細針穿刺物K-ras基因突變率

胰腺癌的K-ras突變陽性率為88.9%(24/27)，其中GGT→GAT 12例，GGT→GTT 10例，GGT→GCT 1例，GGT→CGT 1例，測序圖見圖1。其他惡性腫瘤的突變陽性率為44.4%(4/9)，其中GGT→GAT 2例，GGT→GTT 1例，GGT→GCT 1例。良性胰腺占位的突變陽性率為35.7%(5/14)，GGT→GAT 3例，GGT→GTT 2例。

圖1 檢測到的4種代表性K-ras 12密碼子突變的測序圖

二、K-ras突變對胰腺占位的診斷價值

本組胰腺癌、其他惡性腫瘤、良性胰腺占位患者的CA19-9的陽性率(≥37 U/L)分別為55.6%(15/27)、22.2%(2/9)、28.6%(4/14)，CEA陽性率(≥10 U/L)分別為25.9%(7/27)、44.4%(4/9)、7.1%(1/14)；其他影像學檢查診斷準確率分別為55.6%(15/27)、22.2%(2/9)、28.6%(4/14)；FNA穿刺物組織細胞學診斷陽性率分別為59.3%(16/27)、22.2%(2/9)、0。聯合細胞學檢查和K-ras基因突變檢測，胰腺癌的陽性率高達96.3%。胰腺癌與其他惡性腫瘤比較，穿刺物K-ras突變的敏感性、特異性、陽性預測率、陰性預測率、準確率分別為88.9%、55.6%、85.7%、62.5%、80.6%，相差顯著(P=0.013)；與良性胰腺占位病變比較，分別為88.9%、64.3%、82.8%、75.0%、80.5%，差異亦顯著(P=0.001)。而其他惡性腫瘤與良性胰腺占位的K-ras突變無顯著差異(P=1.00)。

討 論

由于胰腺癌缺乏特異性癥狀，約有85%的患者失去手術機會，故如何提高胰腺癌的診斷水平成為改善胰腺癌患者預后的主要環節。腫瘤相關基因的分子生物學檢測與內鏡影像學檢查聯合診斷方法可能是目前發現早期胰腺癌的有效方法之一。既往報道[6]，胰腺癌K-ras基因突變率在75%～95%，癌前病變PanIN-1a、1b及2-3標本中K-ras的突變率分別為 36%、44%和87%，所以檢測胰腺組織K-ras突變有助于早期胰腺癌的發現。

檢測K-ras突變的方法較多，對于EUS-FNA穿刺物主要采用PCR-SSCP和PCR-RELP方法。PCR-RELP僅可檢測12密碼子的突變，需要兩次PCR和兩次酶切，步驟繁瑣[7-8]；PCR-SSCP對于混有大量正常組織的檢測標本易出現假陰性[9]。本研究采用肽核酸鉗制PCR技術[10]，利用PNA與完全匹配的DNA結合的穩定性遠遠高于不能完全匹配的DNA這一特性[11]，在第一輪PCR引物退火之前引入PNA，使PNA與野生型模板結合，從而在退火期和延伸期抑制野生型模板的擴增。通過設計套式擴增引物，在第二輪PCR時將第一輪擴增產物有效放大，且同時檢測K-ras12、13密碼子的突變。應用該法，本組胰腺癌的檢測靈敏度為88.9%，明顯高于以往文獻報道，聯合組織細胞學結果，靈敏度高達96.3%。在EUS-FNA活檢物檢測K-ras突變對以下患者具有潛在的診斷價值：(1)當找到可疑細胞時，K-ras突變陽性幾乎可確定為惡性腫瘤； (2)當細胞學樣品不足或未找到惡性細胞時，K-ras突變陽性可高度提示惡性腫瘤的診斷，但必須聯合其他臨床檢測進行綜合診斷。

本組2例未獲得影像學、血清學或組織細胞學的明確診斷，通過檢測穿刺物的K-ras突變而明確診斷，提高了胰腺癌的診斷率。

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2009-10-23)

(本文編輯：呂芳萍)

ThevalueoftheK-rasmutationsinFNAsamplesofpancreasonthediagnosisofpancreaticcancer

WANGXiao-wei,GAOJun,RENYan,GUJun-jun,JINZhen-dong,DUYi-qi,ZHANXian-bao,CHENJie,HUANGHao-jie,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the diagnostic value of the K-ras mutations in FNA samples for early detection of pancreatic cancer.MethodsFNA samples of 27 patients with pancreatic cancers, 9 patients with other malignant tumors and 14 patients with non malignant pancreatic mass (NMPM) were collected. DNA was extracted, and K-ras gene was amplified through PNA-mediated PCR clamping, the products were sequenced to determine the mutation type.ResultsThe positive rate of K-ras mutations in pancreatic cancers, other malignant tumors and NMPM were 88.9%, 44.4%, 35.7%. There was significant difference in K-ras gene mutations in FNA samples between pancreatic cancer and other malignant tumors (P=0.013) and NMPM (P=0.001). The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, accuracy of K-ras mutations in FNA samples of pancreatic cancers were 88.9%, 55.6%, 85.7%, 62.5%, 80.6% when compared with other malignant tumors, and the difference between the two groups was significant (P=0.013);Those were 88.9%, 64.3%, 82.8%, 75.0%, 80.5% when compared with NMPM, and the difference between the two groups was significant (P=0.001). When cytology of FNA samples and K-ras mutations was combined, the positive rate of pancreatic cancer was up to 96.3%.ConclusionsThe detection of K-ras mutations in EUS-FNA samples helped improve the positive diagnostic rate of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Peptide nucleic acids; Gene diagnosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.008

國家自然科學基金(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn