髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1在急性壞死性胰腺炎小鼠中的表達

許愛平 路箏 高軍 李淑德 李兆申

·論著·

髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1在急性壞死性胰腺炎小鼠中的表達

許愛平 路箏 高軍 李淑德 李兆申

目的檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺組織中髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1(TREM-1)的表達，探討其在ANP發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法50只雄性昆明小鼠按隨機表法分為對照組，ANP 24、48、72、96 h組。以腹腔注射20%L-精氨酸4 mg/g體重、間隔1 h重復一次的方法制備ANP模型。對照組腹腔注射等容積生理鹽水。取血檢測淀粉酶、肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量；取胰腺組織行病理學檢查并評分；采用實時定量 PCR法檢測外周血白細胞TREM-1 mRNA的表達；免疫組化法檢測胰腺組織TREM-1蛋白表達。結(jié)果ANP 24 h組小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平為(9439±1273)U/L、(84.8±75.9)μmol/L、(158.1±122.1)U/L，均較對照組的(2412±297)U/L、(29.2±19.1)μmol/L、(41.4±7.9)U/L顯著升高。ANP組胰腺組織的病理評分隨著時間推移而增加。ANP 24、48、72、96 h組的TREM-1 mRNA相對表達量分別為15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h組的表達量顯著高于其他時間點組(P值均<0.01)，而胰腺組織TREM-1蛋白表達隨胰腺炎的病程進展無顯著變化。結(jié)論TREM-1可能還通過促發(fā)其他炎癥因子參與ANP的進展過程。

胰腺炎，急性壞死性； 髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1； 炎癥趨化因子類

髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM-1)屬于免疫球蛋白超家族，它可能是觸發(fā)并擴大炎癥反應、介導膿毒性休克的關(guān)鍵介質(zhì)[1]。大量研究結(jié)果證實，TREM-1在膿毒癥、肺部感染、炎癥性腸病、細菌性腦膜炎等炎癥性疾病的鑒別、診斷和預后判斷中有重要價值。Wang等[2]報道，TREM-1 mRNA在輕、重型急性胰腺炎患者的白細胞中表達增加。本實驗觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺組織中TREM-1 mRNA及蛋白的表達，探討TREM-1在胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能機制。

材料和方法

一、實驗動物及分組

健康雄性昆明小鼠50只，清潔級，體重20～22 g，由第二軍醫(yī)大學動物中心提供。按隨機表法分成對照組，ANP 24、48、72、96 h組，每組10只。采用腹腔注射20% L-精氨酸4 mg/g體重、間隔1 h重復注射一次的方法制備ANP模型。對照組腹腔注射等容積生理鹽水。術(shù)后各時間點分批處死小鼠，心臟取血，留取血清和胰腺組織標本。

二、檢測項目及方法

1．血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測：應用HITACHI-7150型自動生化分析儀測定。

2．胰腺病理學檢查：部分胰腺組織常規(guī)行病理學檢查，并參考Rongione標準進行評分。

3．外周血TREM-1 mRNA檢測：外周血分離、棄血清、裂解紅細胞后，應用Trizol抽提白細胞總RNA，置-80℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)Genbank中的基因序列自行設計引物，上游5′-CTGTGCGTGTTCTTTGTC-3′，下游5′-GGTTCCTTCCCGTCTG-3′，產(chǎn)物133 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，產(chǎn)物233 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex TagTM(Takara公司)行熒光實時定量PCR，反應條件:95℃ 10 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s，40個循環(huán)。結(jié)果以Ct值顯示，△Ct值= Ct值目的基因-Ct值內(nèi)參基因；△△Ct值=△Ct值目的基因-△Ct值內(nèi)參基因；以對照組表達量為1，2-△△Ct值即為目的段基因較對照組mRNA表達的倍數(shù)。

4．胰腺組織TREM-1蛋白檢測：采用Envison兩步法檢測。大鼠抗小鼠TREM-1 Antibody購自R&D公司，以PBS代替一抗作為陰性對照。TREM-1定位于胞膜、胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色或棕褐色。光鏡下隨機計數(shù)1000個細胞，計算染色細胞所占的百分數(shù)，≥20%為陽性，<20%為陰性。染色強度：淡黃色為+，黃色++，棕黃色+++，褐色++++。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化

ANP組小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平均較對照組顯著升高。淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶在制模后24 h均達峰值，此后逐漸降低(表1)。

表1 各組血清淀粉酶、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化

注：與對照組比較，aP<0.05

二、胰腺病理變化

對照組小鼠胰腺無明顯變化。ANP 24 h組小鼠肉眼可見腹腔微量腹水;48 h組腹腔有大量血性積液,并見胰腺水腫、壞死;72 h和96 h組病變更為嚴重。鏡下見24 h組胰腺小葉間隙略增寬、水腫、充血、炎細胞浸潤；48 h組胰腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉間水腫、充血、炎細胞浸潤加重；72 h組胰腺大片壞死，中性粒細胞浸潤明顯增加；96 h組炎細胞大量浸潤,彌漫性腺泡細胞壞死,壞死區(qū)周圍炎細胞浸潤,部分腺泡呈孤島狀,核固縮、脂肪組織壞死(圖1)。

ANP各組病理評分見表2。胰腺組織炎癥反應、水腫程度和壞死隨著病程進展程度加重(P<0.05)，出血病變在48、72和96 h組間無統(tǒng)計學差異(P=0.773)。

三、外周血TREM-1 mRNA表達的變化

ANP 24、48、72、96 h組的TREM-1 mRNA相對表達量分別為15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h組的TREM-1 mRNA表達量顯著高于其他時間點組 (P值均< 0.01)。

圖1ANP 24 h組(a)、48 h組(b)、72 h組(c)、96 h組(d)胰腺組織病理改變(HE ×100)

表2 ANP各組胰腺組織病理評分

注：與ANP 24 h組比較，aP<0.05,bP<0.01

四、胰腺組織中TREM-1蛋白表達的變化

對照組胰腺無TREM-1蛋白表達。ANP組有TREM-1的表達(圖2)，24 h時11例TREM-1表達陽性，其中+++以上5例；48 h時11例陽性，+++以上6例；72 h時11例陽性， +++以上6例。TREM-1蛋白表達隨胰腺炎的病程進展無顯著變化。

討 論

Bouchon等[3]應用特異性抗TREM-1單克隆抗體證實了血液中的中性粒細胞和CD14單核/巨噬細胞表達TREM-1。Colonna等[4]報道，正常肺組織的巨噬細胞也表達TREM-1。機體感染時，浸潤的中性粒細胞及被感染的皮膚和淋巴結(jié)中的上皮細胞均能高表達TREM-1。TREM-1可促進炎性因子分泌，引起炎癥反應的增強、放大，導致過度的炎癥反應[5]。此外，TREM-1在天然免疫和獲得性免疫應答方面都起著重要作用。

圖2 ANP組胰腺組織中TREM-1的表達(SP ×400)

Wang等[2]檢測輕、重型急性胰腺炎患者及正常人白細胞中TREM-1 mRNA的表達，結(jié)果顯示，與正常人相比較，急性胰腺炎(AP)患者白細胞中TREM-1的表達量明顯上調(diào)，且與患者病情嚴重程度密切相關(guān)，推測TREM-1在AP尤其是SAP的發(fā)生、發(fā)展中可能起著至關(guān)重要的作用。

本實驗結(jié)果顯示，ANP小鼠外周血中TREM-1 mRNA 的水平隨著病程的進展逐漸升高，48 h達到頂峰，后逐漸下降，表明TREM-1的表達并非隨著病程的進展呈線型增高。此外，胰腺組織中TREM-1蛋白表達隨ANP的病程進展亦無顯著變化。因此，初步推測TREM-1作為炎癥介質(zhì)在炎癥反應過程中可能還通過促發(fā)其他炎癥因子參與整個疾病進程。

[1] Bouchon A,Facchetti F,Weigand MA,et al.TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature,2001,410:1103-1107.

[2] Wang DY,Qin RY,Liu ZR,et al.Expression of TREM-1 mRNA in acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2004,10:2744-2746.

[3] Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes.J Immunol,2000,164:4991-4995.

[4] Colonna M,Facchetti F.TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells):a new player in acute inflammatory responses.J Infect Dis,2003,187:S397-S401.

[5] Radsak MP,Salih HR,Rammensee HG,et al.Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival.J Immunol,2004,172:4956-4963.

2009-11-13)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofTREM-1inmicewithacutenecrotizingpancreatitis

XUAi-ping,LUZheng,GAOJun,LIShu-de,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-Shen,Email;zhsli@81890.net

ObjectiveTo detect the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1(TREM-1) in mice with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsMale kunming mice (n=50) were randomly divided to control group, ANP 24, 48, 72, 96 h group. ANP model was induced by intraperitoneally injection with 20% L-arginine at a dose of 4 mg/g each, 1 h apart. Mice in control group

intraperitoneally injections of same amount of normal saline. Serum amylase, creatinine, and ALT were examined and pathological evaluation of pancreatic tissues was performed. The expression of TREM-1 mRNA in peripheral blood leucocyte was determined by RT-PCR. The expression of TREM-1 protein in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsSerum amylase, creatinine, and ALT in ANP 24 h were (9439±1273)U/L, (84.8±75.9)μmol/L, (158.1±122.1)U/L, which were significantly higher than those in control group [(2412±297)U/L,(29.2±19.1)μmol/L, (41.4±7.9)U/L)]. The pathological scores of the pancreas in ANP group increased corresponding to time. The expressions of TREM-1 mRNA in ANP 24, 48, 72, 96 h group were 15.55, 30.36, 15.77, 28.32, and the expressions of TREM-1 mRNA in ANP 48 h group was significantly higher than that in other groups (P<0.01). The expressions of TREM-1 protein in the pancreas did not significantly change corresponding to time.ConclusionsTREM-1 may be involved in the development of ANP by triggering other inflammatory factors.

Pancreatitis，acute necrotizing； Triggering receptor expressed on myeloid cells-1； Chemokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.014

2008年度國家自然科學基金面上項目(30772138)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化科

李兆申，Email：zhsli@81890.net