胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

郭杰芳 高軍 李兆申 龔燕芳 金晶 滿曉華 吳紅玉

·論著·

胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

郭杰芳 高軍 李兆申 龔燕芳 金晶 滿曉華 吳紅玉

目的檢測(cè)胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)情況,探討其臨床意義。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)35例胰腺癌組織及27例癌旁正常胰腺組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)，并分析它們與相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果胰腺癌組織GLI1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.12～3.65，中位數(shù)為1.19；PTCH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.82～4.36，中位數(shù)為2.36。癌旁正常胰腺組織的GLI1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.23～2.76，中位數(shù)為0.87；PTCH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.11～2.17，中位數(shù)為0.58。癌組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05)，且GLI1 mRNA與PTCH1 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.532，P<0.05)；GLI1 mRNA的表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論GLI1、PTCH1基因參與胰腺癌的發(fā)生；GLI1的表達(dá)與胰腺癌的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

胰腺腫瘤； GLI1； PTCH1； 腫瘤侵襲； 腫瘤轉(zhuǎn)移

目前研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號(hào)通路(Hh信號(hào)通路)的異常激活與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。PTCH1、GLI1分別是該通路的跨膜蛋白質(zhì)受體及下游的轉(zhuǎn)錄激活因子，兩者在該通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)情況，分析其與胰腺癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床開發(fā)診斷與治療胰腺癌的新方法提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、臨床資料

收集2004年4月至2006年5月我院外科手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的35例胰腺癌患者。所有病例均有完整的手術(shù)記錄及臨床資料。其中男23例，女12例，年齡42～75歲，平均60歲。腫瘤最大徑≤3 cm 15 例, >3 cm 20 例；高分化13例，中低分化22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，未轉(zhuǎn)移18例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移21例。術(shù)中獲取的胰腺癌組織立即置于液氮凍存，同時(shí)獲取的27例癌旁正常胰腺組織(距腫瘤邊緣>5 cm)也置液氮凍存作為對(duì)照。本研究經(jīng)上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

二、GLI1、PTCH1 mRNA的檢測(cè)

取凍存的胰腺癌或癌旁組織標(biāo)本約100 mg，研磨成粉末狀，按3S Trizol總RNA抽提試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書抽提組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度與濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海晶美生物工程有限公司)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再在Lightcycler 2.0 system 熒光定量PCR儀(Roche Diagnostics Ltd)上行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GLI1 mRNA 及PTCH1 mRNA。根據(jù)GLI1及PTCH1序列自行設(shè)計(jì)引物， GLI1上游引物為5′-TGTGTATGAAACTGACTGCCG-3′，下游引物為5′-CCCAGTGGCACACGAACTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度125 bp；PTCH1上游引物為5′-TGTGCGCTGTCTTCCTTCTG-3′，下游引物為5′-CACGGCACTGAGCTTGATTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度119 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物為5′-GCCATCCTGCGTCTG-3′，下游引物為5′-TGGGCACCGGAACCGCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度260 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件： 95℃ 30 s， 95℃ 5 s、55℃ 20 s、72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析 95℃ 0 s、65℃ 15 s、95℃ 20 s。以相對(duì)定量法(ΔΔCT法)計(jì)算GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩組目的基因表達(dá)量的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌及癌旁正常組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)

35例胰腺癌標(biāo)本及27例癌旁正常組織均可檢測(cè)到GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)。胰腺癌組織GLI1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.12～3.65，中位數(shù)為1.19；PTCH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.82～4.36，中位數(shù)為2.36。癌旁正常胰腺組織的GLI1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.23～2.76，中位數(shù)為0.87；PTCH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.11～2.17，中位數(shù)為0.58。癌組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05， 圖1、2)。胰腺癌組織中GLIl mRNA的表達(dá)量與PTCH1 mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.532，P<0.05)。

圖1胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中GLI1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中PTCH1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

二、GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)與胰腺癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性

GLI1 mRNA的表達(dá)量與胰腺癌的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(r=0.312，P<0.05；r=0.298，P<0.05)，與腫瘤大小、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。PTCH1 mRNA的表達(dá)量與腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

表1胰腺癌GLI1、PTCH1 mRNA表達(dá)量與腫瘤臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

臨床指標(biāo)GLI1mRNA表達(dá)量r(P)PTCH1mRNA表達(dá)量r(P)腫瘤大小0.176(0.172)0.125(0.213)分化程度0.312(0.035)0.152(0.185)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.298(0.041)-0.139(0.207)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.107(0.276)-0.064(0.324)

討 論

胰腺癌惡性程度高，進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，預(yù)后極差。因此積極探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有非常重要的意義。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)通路與多種惡性腫瘤(包括胰腺癌)的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物Hh通路是由HH 配體、兩個(gè)跨膜蛋白質(zhì)受體PTCH和SMO所構(gòu)成的復(fù)合物及下游的轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白等組成。在沒有HH配體刺激時(shí),PTCH抑制了SMO的活性。當(dāng)HH與PTCH結(jié)合后，PTCH對(duì)SMO的抑制作用被解除，SMO進(jìn)入胞內(nèi)，激活下游轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控多種靶基因的表達(dá)。GLI1是該通路末端具有很強(qiáng)的激活功能的轉(zhuǎn)錄因子之一，可將細(xì)胞外的HH信號(hào)向胞核內(nèi)傳遞，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。PTCH1既是該通路的跨膜蛋白質(zhì)受體，又是該通路的靶基因之一。因此，PTCH1、GLI1是該通路的兩個(gè)重要成員，是反映Hh通路活性程度的可靠指標(biāo)[3]。

本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于癌旁正常胰腺組織，提示胰腺癌組織中存在著Hh通路的過(guò)度激活，這與前期研究結(jié)果一致[4-5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，GLI1 mRNA的表達(dá)量與PTCH1 mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，推測(cè)這可能與PTCH1是Hh通路的下游靶基因有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)GLI1、PTCH1可作為評(píng)估Hh通路活性程度的可靠指標(biāo)。

Xuan等[6]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中Hh通路成員，結(jié)果Ihh、GLI1,2,3的表達(dá)水平與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，且Ihh、PTCH、GLI2與其臨床分期相關(guān)，提示Hh通路在乳腺癌的淋巴路播散和進(jìn)展中起重要作用。Gialmanidis等[7]檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌中Hh通路成員的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組SMO的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，提示Hh通路與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性分析顯示，GLI1 mRNA的表達(dá)量與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示Hh通路可能參予了胰腺癌的侵襲及淋巴路的轉(zhuǎn)移，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。但有關(guān)該通路在促進(jìn)腫瘤侵襲與淋巴轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

[1] Hidalgo M,Maitra A.The hedgehog pathway and pancreatic cancer.N Engl J Med,2009,361:2094-2096.

[2] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes:mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

[3] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes: mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

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[6] Xuan Y,Lin Z.Expression of Indian Hedgehog signaling molecules in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135:235-240.

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2010-03-03)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofGLI1andPTCH1mRNAandytscorrelationwithclinicalparametersinpancreaticcancer

GUOJie-fang,GAOJun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,JINJing,MANXiao-hua,WUHong-yu.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：LIZhao-shen,Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer and study its clinical significance.MethodsReal-time fluorescence quantitative PCR (RFQ-PCR) was used to detect the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in 35 samples of pancreatic cancer tissues and 27 samples of adjacent normal pancreatic tissues, and the correlation of GLI1 and PTCH1 mRNA expression with clinical parameters was investigated.ResultsThe relative expression of GLI1 mRNA in pancreatic cancer tissues was 1.12～3.65 (median 1.19), the relative expression of TCH1 mRNA was 1.82～4.36 (median 2.36). The relative expression of GLI1 mRNA in adjacent normal pancreatic tissues was 0.23～2.76 (median 0.87), the relative expression of PTCH1 mRNA was 1.11～2.17 (median 0.58). Both the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in normal pancreatic tissues(P<0.05), and a positive correlation was found between GLI1 and PTCH1 mRNA expression levels (P<0.05).The expression of GLI1 mRNA was significantly correlated with the differentiation degree and lymph node metastasis of pancreatic cancer (P<0.05).ConclusionsGLI1 and PTCH1 may be involved in pancreatic carcinogenesis, and GLI1 may be related to invasion and lymph node metastasis of pancreatic cancer．

Pancreatic neoplasms； GLI1； PTCH1； Neoplasm invasiveness； Neoplasm metastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.016

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn