羥乙基淀粉(130/0.4)對急性壞死性胰腺炎大鼠腦毛細血管滲漏的影響

陳德招 黃鶴光

羥乙基淀粉(130/0.4)對急性壞死性胰腺炎大鼠腦毛細血管滲漏的影響

陳德招 黃鶴光

重癥急性胰腺炎(SAP)常發生嚴重的毛細血管滲漏綜合征(capillary leak syndrome，CLS)，血管內水分迅速進入組織間隙，引起全身水腫及有效循環血量下降，重要臟器灌注不足。SAP并發的胰性腦病(pancreatic encephalopathy，PE)是SAP病程中出現的嚴重并發癥，其發病機制與腦的毛細血管滲漏密切相關。水通道蛋白4(AQP4)是腦組織內最重要的水通道蛋白，本研究探討AQP4在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腦毛細血管滲漏中的作用。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：雄性SD大鼠48只，購自中國科學院上海實驗動物中心，體重200～250 g。按完全隨機法分為假手術組、ANP組和羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)治療組。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)1.0 ml/kg體重制備ANP模型[1]。HES組在建模后即經右側股靜脈微注泵注入HES 130/0.4 15 ml/kg體重。假手術組僅輕輕翻動十二指腸及胰腺。各組于術后6、24 h經下腔靜脈采血2 ml，并切取胰腺、腦組織。

2．血清TNF-α檢測：采用ELISA法，按試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)說明書操作。

3．腦組織含水量測定：取腦組織右側全部額葉，濾紙吸干表面水分，用分析天枰稱濕重后置110℃烘烤24 h至恒重，再稱干重。腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

4．胰腺、腦組織病理學檢查：按常規操作。

5．AQP4 mRNA檢測：按試劑盒(Fermentas公司)說明書抽提腦組織總mRNA，采用RT-PCR法檢測AQP4 mRNA的表達。引物序列：AQP4上游5′-GAAAGATCAGCATCGCCAAGTC-3′，下游5′-GCAACGGAACCAGTAACATCAG-3′，擴增片段247 bp；內參β-actin上游5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′,下游5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′，擴增片段150 bp。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物電泳后掃描，以AQP4與β-actin擴增片段的灰度值之比作為AQP4 mRNA相對表達量。

6．AQP4蛋白檢測：應用免疫組織化學方法。按PV-6001通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)說明書操作。高倍鏡下隨機選取5個視野，應用十三點評分法計算陽性細胞數。無陽性細胞為0分；陽性細胞<10%為1分；10%～50%為2分；>50%～80%為3分；>80%為4分。染色強度按陰性、弱、中、強染色分別評為0～3分。兩分值相乘作為AQP4蛋白表達值，取5個視野的均數。

二、結果

1．血清TNF-α含量變化：ANP組6、24 h血清TNF-α分別為(97.14±6.70)pmol/ml和(148.49±24.77)pmol/ml；HES組為(78.29±4.77)pmol/ml和(112.50±7.11)pmol/ml；假手術組為(35.84±11.91)pmol/ml和(38.58±12.22)pmol/ml。ANP組和HFS組均顯著高于假手術組，HES組又較ANP組顯著降低(P值均<0.05)。

2．胰腺、腦組織病理學改變：假手術組胰腺組織無明顯改變(圖1a)。ANP組胰腺腫大，大片凝固性壞死、出血，大量炎性細胞浸潤(圖1b)。HES組胰腺壞死和炎細胞浸潤程度較ANP組減輕。

圖1 對照組(a)和ANP組(b)胰腺的病理改變(HE ×400)

假手術組腦組織無明顯改變(圖2a)。ANP組腦組織毛細血管擴張、充血、腦組織疏松、神經細胞水腫(圖2b)。HES組腦組織毛細血管擴張充血程度較ANP組減輕(圖2c)。

圖2對照組(a)、ANP組(b)及HES治療組(c)腦組織病理改變(HE ×400)

3．腦組織含水率變化：ANP組6、24 h腦組織含水率分別為(79.72±0.62)%、(80.44±0.54)%，顯著高于假手術組的(76.98±0.57)%、(77.30±0.83)%(P<0.05)；HES組分別為(78.13±0.25)%和(78.59±0.42)%，較ANP組顯著降低(P<0.05)。

4．AQP4 mRNA和蛋白表達變化：ANP組6、24 h腦組織AQP4 mRNA表達量為0.7735±0.0243、0.8142±0.0168，顯著高于假手術組的0.5083±0.0466和0.5480±0.0488(P<0.05)；HES組分別為0.6767±0.0255、0.7181±0.0188，高于假手術組，但顯著低于ANP組(P<0.05)。

ANP組6、12 h腦組織AQP4蛋白表達量分別為6.88±1.89、7.50±1.60，顯著高于假手術組的3.25±1.04和3.50±0.93(P<0.05)；HES組分別為4.63±2.07、5.63±1.69，高于假手術組，但顯著低于ANP組(P<0.05)。

討論研究顯示[2-3]，SAP繼發的腦組織損傷與炎癥因子TNF-α和IL-1引起腦的毛細血管內皮損傷密切相關。本實驗ANP組血清TNF-α、腦組織含水率較假手術組顯著升高，提示其發生機制與ANP時發生全身炎性反應綜合征(SIRS)關系密切。

AQP4是中樞神經系統中分布較廣泛的水通道蛋白，主要表達于腦內毛細血管的內皮細胞、星形膠質細胞和室管膜

細胞內，尤其富集于與毛細血管和軟腦膜直接接觸的膠質細胞中。這種分布特點提示AQP4在維持大腦水平衡中起重要作用。Manley等[4]報道，AQP4在缺氧、缺血、創傷及腫瘤性腦水腫情況下表達增強。Marios等[5]報道，AQP4可促進腦水腫形成，與血腦屏障(BBB)的完整性相關。Tomás等[6]報道，隨著BBB的破壞，AQP4的表達上調，提示BBB破壞可能是導致AQP4表達增加的原因。

本實驗結果顯示HES組血清TNF-α、腦含水率、AQP4 mRNA及蛋白表達量均較ANP組顯著下降，推測羥乙基淀粉可能通過其抗炎作用抑制TNF-α的釋放，抑制內皮細胞活化從而阻斷白細胞的黏附及遷移，減輕其對腦血管內皮細胞及血腦屏障的損傷，間接下調腦的毛細血管內皮的AQP4表達，緩解腦毛細血管滲漏的作用。

[1] 楊波，黃鶴光，陳大良，等.逆行性胰膽管注射法制作重癥急性胰腺炎大鼠模型.福建醫科大學學報，2002，36:71-72.

[2] Norman J.The role of cytokines the pathogenesis of acute pancreatitis．Am J Surg，1998，175：76-83．

[3] Yang YL，Li JP，Li KZ，et al.Tumor necrosis factor alpha antibody prevents brain damage of rats with acute necrotizing pancreatitis. World J Gastroenterol，2O04，10：2898-2900．

[4] Manley GT，Fujimura M，Ma T，et al．Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water introxication and ischemic stroke．Nat Med，2000，6：159-163．

[5] Marios C，Papadopoulos，Geoffrey T，et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema．Faseb J，2004，18：1291-1293．

[6] Tomás-Camardiel M，Venero JL，Herrera AJ，et al.Blood-brain barrier disruption highly induce aquaporin-4 mRNA and protein in perivascular and parenchymal astrocytes: protective effect by estradiol treatment in overienctomized animals.J Neurosci Res，2005，80：235-246．

2009-07-17)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.025

福建省自然科學基金(2008J0086)

350001 福州，福建醫科大學附屬協和醫院普外科

黃鶴光，Email:hhuang@yahoo.com.cn