云南松成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導條件探究

王企珂，于大德，王 晟

（北京林業大學，北京 100083）

云南松（Pinus yunnanensis）廣泛分布于我國四川西南部、云南、西藏東南部、貴州西部、廣西西部等地。該樹種喜光，耐干旱耐瘠薄，適應酸性的紅壤、黃壤，在其他樹種不能生長的貧瘠石礫地和沖刷嚴重的荒山坡地也能生長，是西南地區荒山造林的先鋒樹種。其木材是優質的造紙、人造板原料，具有較高的濟價值。大量繁殖云南松，對保護這一我國特有樹種并發揮其環境、經濟方面的價值有著十分重要的意義。但由于松屬植物本身的扦插繁殖困難，而種子繁殖速度慢、周期長、發芽率低，嚴重限制了其大規模繁殖。體外胚胎發生是一種重要、有效的無性繁殖手段，但在針葉樹種中應用還不多，主要由于缺乏經濟有效的組織培養方法[1～2]。

黃健秋等使用云南松成熟種子成功獲得了云南松的完整小植株，但其培育時間較長，特別是胚性愈傷組織誘導率最高只有35.8%，轉化率也比較低，其實驗過程中，未探究對種子不同處理方法以及不同激素濃度配比對胚性愈傷組織誘導的影響[3]。本文探討了使用云南松成熟種子誘導胚性愈傷組織的方法，使用正交實驗設計，探究了不同的消毒方式及2,4-D與6-BA的不同濃度配比，對云南松成熟種子愈傷組織的誘導成功率的影響，為建立該樹種離體培養技術的生物學基礎，促進現代生物技術在其定向遺傳改良中的應用等提供實驗資料與數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

云南松成熟種子，于2009年11月購自中國林木種子公司，為2008年采收自云南昆明，干燥后一直密封保存于4℃冰箱。使用前先用流水沖洗干凈，浮選法篩選出飽滿健康的種子備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體表面消毒與接種 云南松種子經流水清洗后放入培養皿移入超凈臺中，70%酒精消毒 30 s，無菌水沖洗2 ～ 3次。約100粒種子加入20 mL不同濃度的次氯酸鈉溶液，浸泡20 min，無菌水沖洗2 ～ 3次，剝去種皮與胚乳，取出胚接種于培養基表面。誘導在錐形瓶中進行，每瓶接種5個胚，每個設計設置重復3次。在25±1℃下黑暗培養，每隔3 d觀察記錄。

1.2.2 使用正交設計誘導愈傷組織 本實驗采用DCR培養基作為基礎培養基，蔗糖濃度3%，瓊脂0.6%，肌醇1 000 mg/L，CH 500 mg/L，pH值6.2 ～ 6.8。按照L9(34)正交實驗設計，使用3%、5%、7% 3個濃度的次氯酸鈉溶液對種子進行消毒，添加2,4-D的濃度為15、10、5 mg/L，6-BA的濃度為6、4、2 mg/L，共9組實驗。

1.2.3 小梯度濃度激素配比誘導愈傷組織 在以上實驗基礎上，確定消毒液濃度，再在最佳的激素濃度附近選取3個較小的梯度濃度進行全交叉試驗，以期得到更精確的激素濃度配比。2,4-D的濃度分別為8、10、12 mg/L，6-BA的濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L。培養條件與上述實驗相同。

1.2.4 愈傷組織形態學與細胞學觀察 將完整愈傷組織置于實體顯微鏡下觀察胚性愈傷組織外形，顏色等。細胞學觀察采用壓片法，將少許愈傷組織挑取到載玻片上，滴入少量清水用解剖針展開，輕輕壓片觀察。由于愈傷組織柔弱，壁薄，不可用力過度使細胞破裂。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導過程觀察與胚性愈傷組織觀察

接種后每3 d觀察一次愈傷組織誘導情況，檢查是否有污染，愈傷組織的產生部位、形態、大小、顏色，在2周后鏡檢。如有污染，在第3 d即可出現，根據表面形態可確認污染主要由黏菌與霉菌引起。

在培養基中培養3 d內，外植體明顯變粗，子葉略微伸展開，但無萌發跡象，且表面光滑，無愈傷組織產生（圖1）；培養4 ～ 5 d后，從胚根或下胚軸、子葉產生直徑約2 mm的乳白色半透明粘狀組織（圖2），該組織在6 ～ 10 d內無明顯變化，僅有少量的膨大（圖3）；直到11 d后，開始加速膨大，并延胚軸向子葉方向延伸，到最后直徑可達到1 cm以上；15 d后部分愈傷組織表面產生白色，透明絲狀組織（圖4），此時使用顯微鏡觀察，可看到表面產生透明的圓丘狀凸起（圖5），而非胚性愈傷組織則無此結構。壓片后可見細胞呈粗棒狀，細胞核大，細胞質濃厚（圖6），每一個細胞均有可能發育成為一個胚。有時在同一胚上可觀察到兩種愈傷組織：①下胚軸產生的淺黃、半透明絲狀愈傷組織，結構松軟，表面具有透明凸起；②主要由子葉產生，黃褐色或棕褐色，質地較堅硬，黃色，細胞排列緊密，較小。前者即為胚性愈傷組織。該愈傷組織在一定條件下誘導經過早期原胚—后期原胚—子葉胚階段即可發育成為成熟的體細胞胚。

圖1 接種3d內狀態Figure1 The 3rd day of inoculation

圖2 接種4 ～ 5d時狀態Figure2 The 4th-5th day of inoculation

圖3 接種6 ～ 10 d時狀態Figure3 The 6th-10th day of inoculation

圖4 接種15 d后狀態Figure4 The 15th day of inoculation

圖5 顯微鏡觀察到愈傷組織表面透明凸起Figure5 Transparent structure on the surface of embryogenic callus under microscope

圖6 涂片法觀察到胚性愈傷組織細胞Figure6 Cell structure of embryogenic callus under microscope

在實驗中還觀察到一些胚的子葉在培養基中生長、變粗，長出小的凸起最終形成愈傷組織，但經觀察確認并非胚性愈傷組織。這種情況在小濃度梯度實驗中出現較少，主要是在 6-BA濃度較高的試驗中出現。此外如果在剝出種子的過程中對胚根和胚軸，特別是下胚軸有損傷，則難以發育成為愈傷組織，而如果子葉有受傷，則仍可正常誘導出愈傷組織，說明胚的完整性對愈傷組織的誘導有一定的影響。

2.2 正交實驗結果

重復3批實驗后統計所得數據，得到實驗結果（表1）。

表1 正交試驗結果Table1 Result of orthogonal experiment

2.2.1 消毒劑濃度的選擇 外植體消毒時間過短滅菌不徹底，造成污染，是組培實驗需要極力避免的；而消毒時間過長則造成外植體活力降低甚至殺死外植體。在實驗中曾觀察到如果使用 7%的次氯酸鈉溶液消毒時間過長，外植體接種后無論激素濃度與比例如何，均難以誘導出愈傷組織，且在接種后外植體不膨大也不生長，或者在培養一段時間后即從尖端枯萎。因此在選擇濃度與消毒時間時需要綜合考慮各個因素。

由表中數據可得，在消毒劑濃度過低時（3%），消毒效果不明顯，平均有約20%的污染率。濃度較高時（5%、7%）效果較好，污染率大大減少，僅出現少量偶然的污染。同時為避免消毒劑濃度過高對種子活力的傷害，我們選擇5%作為最佳的消毒劑濃度。

2.2.2 最佳激素濃度選擇 愈傷組織的誘導率因不同激素濃度變化較大（見表1）。總的來說，在6-BA濃度較高時，愈傷得率均較低，此因素與愈傷得率呈顯著相關性。在一定范圍內，愈傷誘導率隨著 2,4-D濃度提高而提高，但超過一定濃度則會降低。實驗結果表明：第5組實驗，即消毒劑濃度5%，2,4-D濃度10 mg/L，6-BA濃度2 mg/L為最佳實驗組合，其愈傷誘導率為68.89%。

由于以上正交實驗未得出在 2,4-D低濃度時，愈傷組織的誘導情況，且無法得到在最佳濃度附近組合對愈傷組織誘導率的影響，因此我們設計了小濃度梯度實驗。

2.3 小濃度梯度實驗結果

設計實驗，在DCR培養基上添加2,4-D濃度分別為8、10、12 mg/L，6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L配比，共9組，設置出小濃度梯度全交叉實驗。其中以2,4-D 10 mg/L，6-BA 1.5 mg/L為最佳組合。

表2 小濃度梯度實驗結果Table2 Result of small concentration gradient experiment

在小梯度誘導實驗過程中，觀察到有一部分愈傷組織產生的速度較快，但最終得到的愈傷組織比率與正交實驗的第5號處理接近。實驗結果確認了正交實驗的結果，2,4-D濃度在一定范圍內，誘導率與6-BA濃度的變化正相關；但濃度過高時（12 mg/L），誘導率隨6-BA濃度升高而降低。表明激素在高濃度處理時對外植體會有一定毒害作用。

該全交叉實驗還得到了6-BA作用的拐點。實驗中還發現，2,4-D/6-BA的數值對實驗結果有較大的影響，當2,4-D/6-BA的值較小時，特別是小于3時，誘導率均較低，通常不超過30%；而2,4-D/6-BA的值在4 ～ 5時，有較高的誘導率，均達到了50%以上，其中最高的可以達到近70%；之后隨著比值繼續升高，誘導率則略有下降，但都維持在30%以上。

3 討論

通過以上實驗證明，使用正交實驗設計，使用DCR培養基，2,4-D與 6-BA作為激素誘導云南松成熟胚產生胚性愈傷組織是可行的。在先前的研究中，曾經得出使用DCR培養基作為基本培養基胚性愈傷組織的得率較低的結論[2]，但經過分析，我們認為DCR培養基也完全可以滿足愈傷組織誘導的需要，且因為DCR培養基在針葉樹種體胚發生中應用廣泛，使用方便，因此仍決定使用該培養基。

外植體的滅菌是所有組織培養的重要環節，如果處理不當其結果將是災難性的。組培實驗中常用的滅菌劑有雙氧水、次氯酸鹽、酒精、升汞、抗生素等[4]，體胚發生中多選用升汞作為消毒劑，但由于抗生素對細菌真菌的抑制效果與抑制時間有限，而升汞含重金屬，對人體有一定毒性，雙氧水則需要較高濃度長時間才可達到效果。表面消毒的基本要求是既要殺死材料表面的全部微生物，又要不傷害材料，需要根據不同的材料，選取適當的消毒劑，合適的濃度和處理時間。綜合考慮效果與環保，本試驗按照前述的原則選擇次氯酸鈉作為消毒劑，選擇滅菌時間15 min。

研究表明，胚性愈傷組織的誘導及體胚發生過程都與外植體的生理狀態、培養基的營養成分、生長調節因子以及多個胚在培養中競爭性等因素關系密切[5]。只有合子胚發育到一定時期，才對外界培養環境有反應，其發育程度對胚性愈傷組織的誘導起決定性作用[6]。通常認為分化程度較低的組織，如未成熟胚，更有利于體細胞胚胎的誘導發生[7]。但未成熟胚的采集困難，受時間與地域限制較大，僅限于胚胎發育的某一時期才有較高誘導率，窗口期很短。因此使用成熟胚誘導愈傷組織是簡化操作、降低成本的有效方法，且此方法可在大規模生產中較為方便地利用。

試驗結果表明，2,4-D可啟動細胞分裂，完成脫分化過程，因此 2,4-D是導致細胞進入細胞周期的關鍵因素[8～9]。2,4-D在一定濃度范圍內，隨其濃度增加，誘導率也增加，但生長素的濃度過高也會對胚性愈傷組織產生毒害作用[10]。在早期誘導中，細胞分裂素含量越高則誘導率越低，但過低也會影響誘導率，而在后期繼代中，可適當提高細胞分裂素的比例，可以使愈傷組織較快地增殖。本實驗采用成熟種子，可以周期性大量供應，無需限時采摘，相比使用未成熟種子來誘導，操作更簡便，且成本更低，得到的誘導率也較黃健秋等人高。小濃度梯度的實驗結果表明，激素濃度的細微調整對愈傷組織與胚性愈傷組織的誘導率均無較大影響，因此激素的比例是誘導率的主要影響因素，此結果與在楊樹等其他植物的愈傷誘導上有相似之處。

有研究認為，不同品種間以及同一品種不同基因型之間，對胚性愈傷組織的誘導及后期胚胎發育方面都有很大差異[11]。在許多研究中使用了不同地區，不同環境下生長的同一物種進行誘導研究，結果差異顯著。本實驗通過比較云南松胚自然呈現的顏色區分，結果黃色胚與白色胚的誘導成功率分別在40%與60%左右。我們在實驗中還發現有的愈傷組織可以抵抗較為不適宜的環境，在誘導培養基中1個月以上不繼代，也不出現褐化且生長良好。這些愈傷組織可被篩選出來大量擴增，建立增殖體系。這種現象說明，基因型對愈傷組織的誘導與增殖確實有一定影響。在今后的應用中如何方便地篩選這樣的基因型，是一個需要深入探究和解決的問題。

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