植物內生真菌殺螺活性菌株篩選

韓邦興,陳 鈞,周曉坤,房偉偉,劉一丹,郝 蕾,牛成成

1江蘇大學藥學院,江蘇鎮江 212013;2植物細胞工程安徽省工程技術研究中心,六安 237012

植物內生真菌殺螺活性菌株篩選

韓邦興1,2,陳 鈞1＊,周曉坤1,房偉偉1,劉一丹1,郝 蕾1,牛成成1

1江蘇大學藥學院,江蘇鎮江 212013;2植物細胞工程安徽省工程技術研究中心,六安 237012

分別從醉魚草和水菖蒲中分離出 99、103株內生真菌,按照WHO殺螺劑浸泡試驗法觀察不同內生真菌以及不同濃度發酵液殺螺效果,用河蝦急性毒性試驗評價其對非靶水生生物毒性。結果表明 LL3026、S38、S21菌株發酵液有較高的殺螺活性,發酵液濃度為 10%時,釘螺死亡率為 100.0%;對河蝦急性毒性較小。

醉魚草;水菖蒲;內生真菌;釘螺;殺螺活性

血吸蟲病嚴重危害人類健康,釘螺是血吸蟲的中間宿主。因此,消滅釘螺是控制血吸蟲病傳播的重要策略[1]。目前使用的化學滅螺劑對非靶生物,尤其是對魚類有很大毒性,加之價格昂貴,從而限制其應用[2]。因此,進行生物滅螺方法研究及生物滅螺劑的開發,彌補化學殺螺劑的不足具有十分重要的意義。在此背景下,微生物滅螺劑篩選方興未艾[3],并篩選出一些能有效殺滅釘螺的菌株[4-6]。

內生真菌(Endophytic fungus)是指其生活史上一定階段生活在活體植物組織內,但對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。植物內生真菌種類豐富,代謝產物活性多樣,是天然活性物質的重要來源[7-8],已成為近年來的研究熱點[9]。

本研究室篩選到有效殺螺植物醉魚草和水菖蒲(另文報道),目前,還沒有關于醉魚草、水菖蒲長期相互作用及共同進化的內生真菌及其代謝產物活性研究。本研究以從醉魚草葉和水菖蒲葉中分別分離得到的 99、103株內生真菌為供試菌株,進行殺螺活性篩選,為開發新型微生物滅螺劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

TDL-5-A飛鴿離心機,上海安亭科學儀器制造廠;SPX-250B生化培養箱,上海躍進集團;QYC-211搖床,上海福瑪試驗設備有限公司;氯硝柳胺,江蘇省血吸蟲病防治研究所提供。

1.2 供試材料

植物材料:醉魚草 B uddleia lindleyana,2008年10月采自安徽中醫學院藥用植物園,經安徽中醫學院藥學院彭華勝副教授鑒定。水菖蒲 Acorus gram ineus,2008年 10月采自江蘇省鎮江市,經江蘇大學藥學院陳鈞教授鑒定。

供試釘螺:釘螺采自江蘇省鎮江市長江邊,系湖北釘螺指名亞種 Oncom elania hupensis,由鎮江市疾病控制中心韓方岸主任醫師鑒定。釘螺于實驗室內適應性飼養 1 d,挑選活力強的釘螺供室內殺螺試驗。

供試河蝦:河蝦采自江蘇省鎮江市長江邊,學名日本沼蝦M acrobranchium nipponense,由江蘇大學韓邦興博士鑒定。

培養基:PDA培養基 (馬鈴薯葡萄糖培養基),臨用時每毫升培養基中加 80單位的青霉素以抑制細菌生長。

1.3 內生真菌分離

自來水洗凈醉魚草葉、水菖蒲葉及莖,分別剪成小段(片),于超凈工作臺上進行表面滅菌。滅菌后的材料植入 PDA平板,置 (28±1)℃培養箱中倒置培養。待莖、葉切面處長出菌絲后,挑取其尖端部分接至新的 PDA平板上,28℃培養,經反復純化后,得醉魚草和水菖蒲內生真菌純培養物。菌株編號后轉入 PDA斜面,于 4℃冰箱保藏備用。

1.4 內生真菌發酵

從斜面挑取純化菌種接種于 PDA平板上,待生長旺盛后,用接種針挑取菌落,接種于裝有 PDA液體培養基的搖瓶中。每搖瓶 (1000 mL)裝入 200 mL。培養基均需 0.1 MPa、121℃、保溫 30 min滅菌。搖瓶靜置 24 h后,置于恒溫搖床上培養。培養溫度 28℃,轉速為 120 r/min,培養時間為 7 d。將內生真菌發酵產物用 4層無菌紗布過濾,濾液 3 000 r/min離心 15 min,棄去沉淀,取上清液,備用。

1.5 殺螺試驗

取發酵液50 mL,用去氯離子水定容至100 mL,即配制成 50%發酵液。浸泡 10只釘螺,另設 1 mg/ L氯硝柳胺水溶液和去氯離子水對照。于 48 h后,棄去藥液,用去氯離子水沖洗釘螺 3次,復蘇 48 h,水測法和壓碎法統計釘螺的死亡數量。水測法是將待測釘螺浸泡于去離子清水中,置于室溫下 48 h,凡能爬壁或吸附于壁的皆為活螺。未吸附于壁的,繼用壓碎法檢測。用上述 50%的發酵液篩選出殺螺率為 100%的菌株,再按上述方法配制成試驗所需要的濃度進行殺螺活性復篩。各組試驗重復 3次。所有去氯離子水組死亡率為 0%,氯硝柳胺組死亡率為100%。

1.6 河蝦急性毒性試驗

取發酵液配制成 2、4、6、8、10%發酵液。每1000 mL稀釋后的發酵液放養 10只河蝦,另設去氯離子水對照。試驗過程中及時撈去死蝦。分別于24、48、72 h統計死亡河蝦數。各組試驗重復 3次。所有去氯離子水組死亡率為0%。

1.7 數據處理

以釘螺和河蝦死亡率為參考序列,應用 SPSS 13.0軟件進行分析,對數據進行均值化和差異性處理,比較各菌株發酵液殺滅釘螺效果和對河蝦的急性毒性。

2 結論與討論

2.1 醉魚草內生真菌殺螺活性菌株篩選

從醉魚草葉中分離出 99株內生真菌。采用WHO推薦的殺螺劑浸泡試驗法對醉魚草內生真菌的殺螺活性進行初步篩選。50%發酵液 48 h殺螺結果表明,55株菌株發酵液殺螺率在 80%以上,占分離的內生真菌總數 55.6%。其中LL3026等 7株菌株發酵液殺螺率為 100%。25%發酵液 48 h殺螺結果顯示,僅 L50198、LL3026發酵液殺螺率為100%。經 12.5%發酵液 48 h殺螺試驗,LL3026菌株發酵液殺螺率仍為 100%。見圖 1。

圖 1 醉魚草內生真菌發酵液的殺螺活性Fig.1 Molluscicidal activity againstOncomelania hupensisof endophyte fungus fromAcorus gram ineus

2.2 水菖蒲內生真菌殺螺活性菌株篩選

從水菖蒲中分離出 103株內生真菌。采用WHO推薦的殺螺劑浸泡試驗法對水菖蒲內生真菌的殺螺活性進行初步篩選。50%發酵液 48 h殺螺結果表明,39株菌株發酵液殺螺率在 80%以上,占分離的內生真菌總數 37.9%。其中 S21等 12株菌株發酵液殺螺率為 100%。25%發酵液 48 h殺螺結果顯示,僅 S21、S38菌株發酵液殺螺率為 100%。經 12.5%發酵液 48 h殺螺試驗,S21、S38菌株發酵液殺螺率仍為100%。見圖2。

圖 2 水菖蒲內生真菌發酵液的殺螺活性Fig.2 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensisof endophyte fungus fromBuddleia lindleyan

2.3 三株殺螺活性菌株活性研究

為進一步研究 LL3026、S38、S21對釘螺的殺滅效果,設置2%～10%濃度梯度的發酵液進行殺螺試驗。試驗結果表明,三株內生真菌不同濃度梯度的發酵液均具有較好的殺螺效果,并都有很強的劑量和時間依賴關系。LL3026不同濃度發酵液 24 h殺螺效果不太理想,殺螺率僅達 23.3%～43.3%;而 2%發酵液 48 h殺螺率可達 83.3%,4%發酵液殺螺率即達 100%。所有濃度發酵液72 h殺螺率都達 100%。S38不同濃度發酵液 24 h殺螺率高于LL3026,達 30%～80%;但 48 h和 72 h殺螺率稍低于LL3026,2%發酵液 48 h殺螺率為 65%,6%發酵液 48 h殺螺率為 100%。而 2%發酵液 72 h殺螺率為 95%,其余濃度殺螺率都達 100%。三株內生真菌中,S21殺螺效果相對最弱,各濃度 24 h殺螺率為10%～50%,48 h殺螺率為 30%～90%;10%發酵液 72 h殺螺率達 100%。見圖 3。

圖 3 LL3026,S38和 S21菌株不同濃度發酵液殺螺活性Fig.3 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensis ofLL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.4 三株殺螺活性菌株的河蝦急性毒性

為考察LL3026、S21、S38三株內生真菌對非靶水生生物的毒性,本試驗選擇河蝦為受試對象,以死亡率為指標進行急性毒性試驗。實驗結果表明,S21各濃度發酵液對河蝦幾無致死作用,10%發酵液 72 h死亡率僅 20%。LL3026對河蝦的致死作用相對較小,各濃度發酵液 24 h死亡率最高為 25%,當發酵液濃度超過 6%時,48 h和 72 h河蝦死亡率明顯上升,分別達 35%～90%,50%～95%。S38菌株發酵液在三者中對河蝦毒性最大,10%發酵液對河蝦24 h死亡率即達 80%,隨時間和濃度增加,S38菌株發酵液對河蝦急性毒性也逐漸增加,10%發酵液 72 h死亡為 100%。見圖 4。

圖 4 LL3026,S38和 S21菌株不同濃度發酵液的河蝦急性毒性Fig.4 M acrobranchium nipponense toxicity assay of LL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.5 討論

實驗結果表明,醉魚草和水菖蒲中內生真菌種類豐富,且廣泛分布著殺螺活性菌株,分別占分離菌株總數的 55.6%和 37.9%;其中 LL3026、S21、S38發酵液具有很強的殺螺活性,4%的 LL3026發酵液48 h殺螺率 100%,6%的 S38發酵液 48 h殺螺率100%,10%的 S21發酵液 72 h殺螺率 100%。三株菌株的殺螺活性均高于本實驗室曾篩選到金錢松內生真菌 JJ18(10%發酵液 72 h殺螺率為 86.7%)[8]。并且在一定濃度下,發酵液對釘螺的毒性遠大于對河蝦的毒性。

從安全、有效的角度考慮,植物內生真菌殺螺研究有廣闊的前景。至今,對內生真菌的殺螺研究還處于一個初始階段,相對于數量龐大的內生真菌種類而言,才剛剛開始[8]。將植物內生真菌的研究與殺螺研究相結合,應用生物組合化學的方法進行活性成分篩選,發現安全、有效的殺螺先導化合物,應用生物技術改良內生真菌,提高活性成分的含量和產量,對推動生物殺螺劑的篩選和可持續利用具有重要意義。

醉魚草和水菖蒲中內生真菌可能產生了殺螺活性物質,可以針對性地進行活性跟蹤研究[10],分離篩選有效的活性物質,并采用生物技術手段提高活性成分含量和產量,使之成為新型殺螺劑的重要來源。

致謝:感謝安徽中醫學院王德群教授、彭華勝副教授、江蘇省血吸蟲病防治研究所梁幼生研究員和江蘇省鎮江市疾病預防控制中心韓方岸主任醫師給予的支持!

1 dos Santos AF,de Azevedo DP,dos Santos Mata Rda C,et al.The lethality of Euphorbia conspicuato adults ofB iom phalaria glabrata,cercaria ofSchistosom a m ansoniand larvae of A rtem ia salina.B ioresour Technol,2007,98:135-139.

2 Andrews P,Thyssen J,LorkeD.The biology and toxicologyof molluscicides,bayluscide.Phar m acol Therapeut,1982,2: 245-295.

3 Zhou XN(周曉農).Science on Oncomelannia Snails(實用釘螺學).Beijing:Science Press,2005.95-96.

4 Tan P(譚蘋),Yang JM(楊建明),Xiao RF(肖瑞芬),et al.Influence of Streptomyces violaceoruber on the enzymehistochemistry inOncom elania hupensis.Acta Zoologica Sinica(動物學報),2006,52:109-114.

5 Chen XL(陳祥麟).Molluscicidal activity againstOncom elania hupensisof pseudomonad.M icrobiology(微生物學通報),1983,10:215-217.

6 Yao CS(姚超素),Hu DY(胡代炎),ShiMZ(石孟芝),et al.Studies on snail killing antibiotic 230.Chin J Antibiotics (中國抗生素雜志),1993,18:261.

7 Suthep W iyakrutta,Nongluksna Sriubolmas,Wattana Panphut,et al.Endophytic fungi with antimicrobial,anticancer and antimalarial activities isolated from Thai medicinal plants.J M icrobiol B iotechn,2004,20:265-272.

8 Guo SB(郭尚彬),Chen J(陳鈞),Wang Y(王妍),et al. Experimental research on molluscicidal effect of endophyte JJ18 fromPseudolarix am abilis.China J Chin M ateria M ed (中國中藥雜志),2008,34:389-392.

9 He RQ(赫榮喬).Plant endophyte becomes one of hot topics in the current microbiological study in China.M icrobiology (微生物學通報),2009,36:1

10 Ni Z W(倪志偉),Li GH(李國紅),Zhao PJ(趙沛基),et al.Antimicrobial Components of the Endophytic Fungal Strain Chaetomium globosum Ly50'fromM aytenus hookeri. Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發),2008,20:33-36.

Screen ing ofM olluscicidal Activity aga instOncom elania hupensisof Endophyte Fungus

HAN Bang-xing1,2,CHEN Jun1＊,ZHOU Xiao-kun1,FANGWei-wei1,L IU Yi-dan1,HAO Lei1,N IU Cheng-cheng11School of Phar m acy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2Research Center of Plant Cell Engineering of Anhui Province,Lu’an 237012,China

Molluscicidal testswere performed according to the immersion test suggested byWHO to screen molluscicidal activity endophyte funguswhichwere isolated from Buddleia lindleyana andAcorus gramineus.TheMacrobranchium nipponense toxicity assaywas used to appraise toxicity to non target aquatic species.The result indicated that the LL3026, S38 and S21 broth had significant activity against Oncomelania hupensis.The mortality rates of snails immersed by LL3026,S38 and S21 broth were 100.0%at the concertration of 10%,respectively.The endophyte fungus had no acute toxicity toMacrobranchium nipponense.

Buddleia lindleyana;Acorus gram ineus;Endophyte;Oncom elania hupensis;Molluscicidal effect

1001-6880(2010)02-0315-04

2009-08-24 接受日期:2009-11-24

＊通訊作者 Tel:0511-88780196,Email:syxchenjun@126.com

R383.24

A