蘄蛇蛇毒中一種新型金屬蛋白酶AA-MP-I的純化和表征

潘劍茹,何火聰,劉 枋,饒平凡＊

1福州大學生物工程研究所,福州 350002;2福建省腫瘤醫院,福州 350014

蘄蛇蛇毒中一種新型金屬蛋白酶AA-MP-I的純化和表征

潘劍茹1,何火聰2,劉 枋2,饒平凡1＊

1福州大學生物工程研究所,福州 350002;2福建省腫瘤醫院,福州 350014

本研究通過嗜硫色譜、Sephadex G-75、藍膠和 POROS HQ 20離子交換色譜,從蘄蛇蛇毒中分離得到一種新組分AA-MP-I。該酶為分子量 22.9 kDa的單體蛋白,等電點為 5.55,不含中性糖基,N端序列為 STEFQRY ME IV IVVDHS MVK,結果表明其為新型 P-I型金屬蛋白酶,對溫度敏感,具有抗凝血活性,40℃下抗凝血活性最強,具有出血毒性,無磷脂酶A2活性。

蘄蛇;蛇毒;金屬蛋白酶;抗凝血;出血毒

蘄蛇,又稱尖吻蝮蛇,是一種劇毒的蛇。福建產蘄蛇來自武夷山,從其蛇毒的粗毒中已分離純化得到多種純組分,如具有凝血酶活力的金屬蛋白,分子量約為 28.0 kDa,具有精氨酸酯酶活力和激活因子ⅩⅢ的活性,但沒有明顯的出血反應[1];分子量24.3 kDa的類凝血酶,不具有激活因子ⅩⅢ的活性[2];分子量約為 25.4 kDa的抗凝血因子,但不具有磷脂酶A2活性、纖溶活性和出血活性[3]等。

蘄蛇蛇毒中還含有很多金屬蛋白酶,蛇毒金屬蛋白酶 (snake venom metalloproteinases,SVMPs)屬于含鋅離子金屬蛋白酶的亞類,蘄蛇咬后常見的局部出血癥狀就是由蛇毒金屬蛋白酶所引起的。這類金屬蛋白酶都含有保守的 Zn離子螯合序列HEXXH,這是實現其蛋白酶活性的基礎片段[4]。金屬蛋白酶的結構有三個部分:金屬蛋白酶、類去整合蛋白和半胱氨酸富集區[5]。根據蛋白質結構域和基因的不同,蛇毒金屬蛋白酶可以劃分為 P-I到 PIV四種類型。P-I型蛇毒金屬蛋白酶分子量最低,只有大約 200個氨基酸,含 Zn2+結合位點的金屬蛋白酶域,這一結構域也是四種類型所共有的結構域, P-II型蛇毒金屬蛋白酶多一個類去整合蛋白結構域,P-III型蛇毒金屬蛋白酶 C端比 P-II型多一個半胱氨酸富集區,P- IV型蛇毒金屬蛋白酶比 P-III型多一個二硫鍵連接的 C-凝集素域[6]。

已經得到的 P-I型金屬蛋白酶有從皖南尖吻蝮蛇蛇毒中純化得到 AaH I、AaH II和 AaH III[7],以及從臺灣五步蛇蛇毒中得到的 AC-1[8]。AaH I、AaH II和AaH III的分子量均為 22 kDa左右,等電點分別為 pH 4.6、5.0和 9.0,都具有出血毒性[7]。AaH I和AaH III通過 cDNA克隆,已得到了蛋白序列,二者的序列同源性為 60%[9,10]。AC-1蛋白分子量為 22.4,等電點為 pH 4.7[8]。AC-1蛋白 N端前20個氨基酸的序列與AaH I相同,全序列的同源性為84%左右。

本研究從武夷山蘄蛇蛇毒中純化得到了一種新型 P-I型金屬蛋白酶AA-MP-I的,并對其理化性質進行了表征。

1 儀器與材料

1.1 儀器

可見紫外分光光度計 (Bioλ-10型,美國 PE公司);恒溫水浴鍋(福建廈門醫療儀器廠)。

1.2 材料

蘄蛇蛇毒購自福建光澤小方蛇業有限公司。Sepharose CL-6B和 Sephadex G-75(Phar macia公司);POROS HQ 20(Applied Biosystems公司);Affigel blue gel(Bio-Rad公司);二乙烯砜 (DVS)和β-巰基乙醇(Sigma公司);兔血漿 (自制:加 0.38%檸檬酸鈉抗凝,4000 r/min,離心 15 min),其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 蛋白質純化

2.1.1 嗜硫色譜

嗜硫色譜按 Scoble和 Scopes[11]的方法制備。嗜硫色譜柱用含 0.1 mol/L Na2SO4,0.02 mol/L PB, pH 7.0緩沖液充分平衡后,將 1 g蛇毒溶于 100 mL上述緩沖液,離心 (10000 r/min)5 min,流動上樣,用相同緩沖液平衡后,用 pH 7.0的 0.02 mol/L PB緩沖液洗脫,線性流速為 0.5 mL/min,檢測波長為280 nm,收集穿透峰,濃縮、透析后待用。

2.1.2 Sephadex G-75凝膠過濾

經處理后的 Sexphadase G-75用 0.02 mol/L PB,pH7.0緩沖液充分平衡后,將上述收集的穿透峰上柱,用相同緩沖液洗脫,線性流速為 0.3 mL/ min,檢測波長為 280 nm。收集第二個洗脫峰 (峰Ⅱ),濃縮、透析后待用。

2.1.3 Blue膠親和色譜

Blue膠用 0.02 mol/L Tris-HCl,pH 7.4緩沖液充分平衡后,將上述峰Ⅱ上柱,用相同緩沖液平衡后,用含 1 mol/L Na2SO4的平衡緩沖液進行洗脫,線性流速為 1 mL/min,檢測波長為 280 nm,收集其穿透峰(Bc),濃縮、透析后待用。

2.1.4 POROS 20 HQ強陰離子交換色譜

POROS 20 HQ強陰離子交換柱用 0.02 mol/L Tris-HCl,pH7.4緩沖液充分平衡后,將上述收集的Bc上柱,用相同緩沖液平衡后,用含 0～0.06 mol/L Na2SO4的平衡緩沖液直線梯度洗脫,線性流速為 1 mL/min,檢測波長為 280 nm,得到蛋白質純品,AAMP-I。

2.2 蛋白質性質鑒定

蛋白質純度用 SDS-PAGE[12]和等電聚焦(IEF)[13]法進行檢測,SDS-PAGE分離膠濃度為12.5%,濃縮膠濃度為 4.4%,工作電壓 150 V,考瑪斯亮藍 R-250染色。總糖含量的測定采用硫酸苯酚法[14],以果糖為標準。蛋白質N端序列利用AB I公司 476A蛋白質序列測定儀測定。

2.3 磷脂酶 A2活性測定

底物的配制采用 Kawauchi等的方法[15]加以改良進行。測活時取 6 mL新鮮配制的底物,攪拌,加入AA-MP-I同時計時,用 0.02 mol/L KOH中和水解產生的脂肪酸,維持 pH在 8.20,根據每毫克AAMP-I消耗 KOH的速度求出 PLA2的活力。

2.4 抗凝血活性測定

比濁法。取兔血漿 0.1 mL與牛凝血酶混合后于 37℃水浴 5 min,加入待測樣品 0.1 mL,振勻后,掃描 10 min內OD 500的吸光值變化。

2.5 蛋白酶活性測定

采用福林–酚試劑法[16]。蛋白酶酶活定義:在40℃,每分鐘水解干酪素產生 1μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。

2.6 出血毒活性測定

每 3只昆明系小白鼠(22±2 g)為一組,不同濃度的樣品液 (樣品溶解液為 0.02 mo1/L,Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液含 0.15 mo1/L NaCl,pH7.0)0.l mL分別皮下注射小鼠背部,6 h后,乙醚處死,剝下小鼠皮膚,測量注射皮膚部位出血斑的面積,取每組的平均值,以面積對劑量作圖。最小出血劑量(MHD)定義為引起 10 mm直徑的出血斑大小所需的劑量[17]。

3 結果與分析

3.1 蛋白質純化

AA-MP-I的純化過程如圖 1所示,蛇毒粗毒先通過嗜硫色譜進行初分離 (圖 1a),收集、濃縮嗜硫色譜的穿透峰,通過 Sephadex G-75分離得到兩個峰(圖 1b),收集第二個峰并將其通過 Blue膠進行親和 (圖 1c),親和所得洗脫峰先進行濃縮、透析,最后利用 POROS HQ 20高效液相色譜進行分離 (圖1d),其梯度洗脫得到的第一個峰即為純組分,命名為AA-MP-I。

圖1 AA-MP-I純化過程Fig.1 Purification scheme ofAA-MP-I

3.2 理化性質

圖2 AA-MP-I的分子量和等電點Fig.2 Molecularweight and isoelectric point ofAA-MP-I

由圖 2a可以看出,還原型和非還原型AA-MP-I在 SDS-PAGE上均表現為單一條帶,結合圖2b的等電聚焦結果,可以肯定純化得到的AA-MP-I以達到電泳純。該蛋白分子量為 22.9 kDa,為單體蛋白,等電點為 5.55,非糖蛋白,N端 15個氨基酸的序列為 STEFQRY ME IV IVVDHS MVK。

3.3 蛋白酶活性

對AA-MP-I進行的蛋白酶活性分析結果表明,該蛋白具有堿性蛋白酶活性,用 1 mmol/L的 EDTA對半稀釋AA-MP-I后,測定其蛋白酶活力。發現這時的蛋白酶活力為零,說明該蛋白是一種金屬蛋白酶,這與序列分析結果相吻合。

如圖 3所示,AA-MP-I蛋白酶活性對溫度比較敏感,37℃水浴時,蛋白酶活性隨水浴時間的增加直線下降,水浴時間 150 min后,AA-MP-I的蛋白酶活性降至 0,水浴溫度大于 40℃時,蛋白酶活性在水浴 30 min后全部喪失。

圖3 AA-MP-I蛋白酶活性的熱穩定性Fig.3 Heat Stability of the proteolytic activity ofAA-MP-I

3.4 抗凝血活性和出血毒活性

據AA-MP-I蛋白 N端序列 blast結果分析,該蛋白可能具有抗凝血活性,體外進行的抗凝血實驗證實了這一結果。

圖 4的結果顯示,AA-MP-I的抗凝血活性對溫度也比較敏感,在25～40℃之間水浴時,抗凝血活性隨水浴溫度的增加而增加,水浴溫度達到 40℃時,抗凝血活性最強,當水浴溫度大于 40℃時,抗凝血活性迅速降低,在 50℃水浴 30 min后,抗凝血活性幾乎全部喪失。

此外,對小鼠背部皮膚所進行的注射實驗結果表明,AA-MP-I具備出血毒活性,其它活性檢驗實驗結果表明,AA-MP-I無磷脂酶A2活性。

圖4 AA-MP-I抗凝血活性的熱穩定性Fig.4 Heat stability of the anticoagulant activity ofAA-MP-I

4 討論

由表 1可以看出,幾種 P-I型蛇毒金屬蛋白酶分子量都在 22～23 kDa之間,除了未得到序列的AaH II[7]外,幾種蛋白的N端序列都具有同源性,其中本研究得到的AA-MP-I蛋白、AaH I[7,9]和AC-1[8]蛋白的N端序列完全相同。但將AaH I和AC-1蛋白的全序列進行比對后發現,二者整體序列的同源性僅為 84%,雖然二者 N端 20個氨基酸序列相同,分子量和等電點相似,但二者為不同的蛋白質。將 AaH I[7,9]和 Acutolysin C[7-10]分子量相同,但等電點相差很大,N端序列同源性僅為 60%。由此可知,由于蛇毒蛋白的復雜性,判斷兩個蛇毒蛋白是否相同,不能單純依靠分子量、等電點或 N端序列等單一指標,而要結合多方面的特征來判斷。本研究純化得到的AA-MP-I蛋白,雖然N端序列與AaH I和AC-1蛋白的相同,但分子量和等電點與這兩種蛋白差異較大,因此可以判定AA-MP-I蛋白是一種新型 P-I型蛇毒金屬蛋白酶,其與AaH I和AC-1蛋白的差別可能是由于幾種蛇毒來源地差異引起的。為進一步研究三種蛋白的差異性,下一步將鑒定AA-MP-I蛋白全序列。

表 1 蘄蛇蛇毒中的 P-I SVMPsTable 1 P-I SVMPs from venom ofAgkistrodon acutus

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Purification and Characterization of a NovelM etalloproteinase AA-M P-I from the Venom ofAgkistrodon acutus

PAN Jian-ru1,HE Huo-cong2,L IU Fang2,RAO Ping-fan1＊1Institute of B iotechnology,Fuzhou University,Fuzhou 350002,China;2Fujian Provincial Tum or Hospital,Fuzhou 350014,China

A novel P-I snake venom metalloproteinase AA-MP-Iwas purified from the venom ofAgkistrodon acutusby using thiophilic adsorption chromatography,Sephadex G-75,Affi-gel blue gel,and POROS HQ 20 anion-exchange chromatography.AA-MP-Iwas a monomerwith the molecularweight of approx imate 22.9 kDa on SDS-PAGE and its isoelectric pointwas 5.55 analyzed by IEF.AA-MP-I hasn’t any neutral carbohydrate and itsN-terminal amino acid sequence was STEFQRY ME IV IVVDHS MVK.AA-MP-I has basic proteolytic and antithrombin activities,both of which are heat-unstable.In addition,AA-MP-Iwas proved to have hemorrhagic activity but no acidic phospholipase A2activity.

Agkistrodon acutus;venom;metalloproteinase;antithrombin;hemorrhage activity

1001-6880(2010)06-0929-05

2009-03-24 接受日期:2009-05-18

福建省科技廳重點項目(2000Z143)

＊通訊作者 E-mail:pfrao@fzu.edu.cn

Q556+.9;R285

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