Enterobacter cloacaeZ0206細菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

徐春蘭,欽傳光,牛衛寧,尚曉婭

西北工業大學生命科學院,西安 710072

Enterobacter cloacaeZ0206細菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

徐春蘭,欽傳光＊,牛衛寧,尚曉婭

西北工業大學生命科學院,西安 710072

本實驗旨在對 Enterobacter cloacaeZ0206菌進行發酵培養,以制備胞外多糖,并對其體外抗氧化活性進行初步研究。通過產多糖菌 E.cloacaeZ0206的深層發酵制備細菌胞外多糖,在此基礎上對其清除DPPH自由基、超氧陰離子、抑制羥自由基的能力以及還原力等四個方面進行實驗,評價其抗氧化活性。結果表明,深層發酵制備的 E.cloacaeZ0206胞外多糖產量為 6.62 g/L,其在 5 mg/mL時對DPPH自由基和羥自由基的清除率分別達到 61.57%和 40.08%。提示 E.cloacaeZ0206細菌胞外多糖具有顯著的抗氧化能力,具有開發為抗氧化類食品或藥品的潛力。

Enterobacter cloacae;胞外多糖;自由基;抗氧化

隨著自由基生物學和醫學研究的日趨深入和發展,活性氧自由基的致病作用機制研究正引起人們的巨大關注[1-3]。大量的研究表明,抗氧化劑可以通過自由基清除作用機制來降低或緩解細胞損傷甚至凋亡[4,5],降低疾病的發生率。然而,化學合成類抗氧化劑大多有毒副作用,因此,尋找低毒或無毒的天然抗氧化劑具有十分重要意義。

多糖是自然界中含量最豐富的物質之一,也是與人類生活緊密相關的一類生物高分子。多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多種重要的生物學功能,因此,對多糖的研究已成為功能食品界的熱門領域。國內外近年來對于多糖的抗氧化作用進行了廣泛的研究[6,7],并有人據此解釋了多糖抗衰老功效的藥理機理,多糖的抗氧化作用已經成為最為活躍的研究課題之一。通常植物和藻類來源的多糖較為普遍,但近些年來,微生物來源的多糖也引起人們的廣泛關注,尤其是細菌和真菌來源的胞外多糖,因其易于分離純化而且產量高等優點在工業生產中頗受人們青睞[8,9]。

本研究首次對從肉靈芝上分離的陰溝腸桿菌Enterobacter cloacaeZ0206進行發酵培養,并對其所分泌的胞外多糖 (Exopolysaccharide,EPS)的體外抗氧化活性進行研究,以期為 E.cloacaeZ0206胞外多糖藥物及功能性食品研究開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacaeZ0206,由浙江大學汪以真教授饋贈。

1.1.2 培養基

改良 PDA培養基:20%的馬鈴薯浸汁,蛋白胨3 g,酵母提取物 3 g,蔗糖20 g,瓊脂16 g,蒸餾水定容至 1000 mL,自然 pH值;基礎發酵培養基:改良的PDY培養基 (不加瓊脂的改良 PDA培養基);20%的馬鈴薯浸汁的制備:將馬鈴薯 200 g洗凈去皮切片,加蒸餾水煮沸半個小時,4層紗布過濾,濾液于 4℃下冷藏 24 h,5000 r/min離心,棄沉淀得到的上清液即20%的馬鈴薯浸汁。

1.1.3 主要試劑和儀器

葡萄糖、無水乙醇、丙酮、正丁醇、硫酸亞鐵、鹽酸、乙醚、氯仿、Vc均為國產分析純;1,1-二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)購自 Sigma公司;鄰苯三酚購自中國醫藥集團上海化學試劑公司;其他試劑均為國產分析純。752型紫外可見分光光度計,由上海第三分析儀器廠生產;DK-8D數顯電熱恒溫水槽,由上海森信實驗儀器有限公司生產;EYELA N-1000旋轉蒸發儀,由日本東京理化器械株式會社生產;D-78532 Tuttlingen、Universal R臺式冷凍離心機,德國;冷凍干燥機(ChristALPHA 1-2),德國。

1.2 方法

1.2.1 E.cloacaeZ0206胞外多糖(EPS)的制備

取出冷藏的 E.cloacaeZ0206菌種,室溫放置 1h后,在 PDA培養基上 2次活化后,接種到基礎發酵培養基中進行試管發酵培養,30℃往復振蕩培養,培養時間 10 h,得到搖瓶發酵種子液。2000 mL搖瓶內裝入 500 mL基礎發酵培養基,121℃蒸汽滅菌20 min,接種種子液,發酵時間 48 h,得到含有 E.cloacaeZ0206的發酵液。發酵液于 50℃濃縮為原體積的 1/10,90℃水浴 1 h,5000 rpm離心 15 min,收集上清液,加入 3～5倍體積預冷的 95%乙醇,4℃靜置 24 h后,5000 rpm離心 15 min,沉淀真空干燥,即得到粗多糖粉末。將其溶于適量蒸餾水,Sevag法除蛋白,反復進行多次至無蛋白層,然后用自來水透析和蒸餾水各透析 24 h,透析液中加無水乙醇,置 4℃冰箱中醇沉過夜,再離心分離,沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌 2次,真空干燥,即得到 E.cloacaeZ0206胞外多糖精品 (EPS)。其中多糖的測定采用苯酚-硫酸法,蛋白質含量的測定用考馬斯亮藍法。

1.2.2 清除DPPH自由基試驗

準確地將 EPS配成 5.0 mg/mL,用超純水將該溶液稀釋成 6種濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5.0 mg/mL。以維生素 C(Vc)為對照品。稱取 20 mg的DPPH用無水乙醇溶解定容至 500 mL。試驗分為樣品組和空白對照組:取 2 mL 40 mg/L的DPPH溶液加入 10 mL具塞的試管中,再加入 2 mL樣品溶液,空白對照組以超純水代替樣品溶液,充分混勻,室溫下避光反應 30 min后,在 517 nm處測定吸光度。EPS清除 DPPH自由基的能力由下式計算: DPPH自由基清除率(%)=(A0– A1)/A0×100%,式中A0為空白對照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.3 清除羥自由基試驗

將 EPS用雙蒸水配制成質量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。各取 2 mL上述濃度的多糖溶液,依次加入 6 mmol/L的 FeSO4溶液 2 mL,混勻,6 mmol/L的 H2O2溶液 2 mL,混勻,靜置 30 min后于 510 nm處測其吸光度值。空白對照組以雙蒸水代替多糖溶液,以維生素 C(Vc)做對照,臨用前以雙蒸水配制。羥自由基的清除率以下式計算:羥自由基清除率 (%)=(A0– A1)/A0×100%,式中A0為空白對照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基試驗

將 EPS用雙蒸水配制成質量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。取 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)4.5 mL,置于 25℃水浴中預熱25 min,分別加入 1 mL不同濃度的多糖溶液和 0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,空白對照組以雙蒸水代替多糖溶液,混勻后在 25℃水浴中反應 5 min,加入 1 mL 8 mol/L的 HCl終止反應,于 299 nm處測吸光度。超氧陰離子的清除率以下式計算:超氧陰離子的清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%,式中 A0為空白對照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.5 還原能力的測定

將 EPS用雙蒸水配制成質量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL,各取 1 mL上述濃度的多糖溶液,加入 pH=6.6的磷酸鹽緩沖液 2.5 mL、1%鐵氰化鉀 2.5 mL,混合均勻后于 50℃水浴中保溫 20 min,再加入10%的三氯乙酸 2.5 mL,混勻,以3000 rpm離心 10 min,移取上清液 2.5 mL于試管中,加蒸餾水2.5 mL和 0.1%FeCl30.5 mL,常溫反應 5 min后于 700 nm處測定吸光度值。用Vc做對照,臨用前用雙蒸水配制。

2 結果與討論

2.1 E.cloacaeZ0206胞外多糖的制備及其多糖和蛋白質含量的測定

將產多糖菌 E.cloacaeZ0206進行深層發酵后,發酵液經濃縮、水煮醇沉、離心,冷凍干燥等過程,得到白色粉末為胞外多糖粗品,產率為 6.62 g/L;進一步經 Sevag法脫蛋白,丙酮、乙醚洗滌,真空冷凍干燥,得到白色胞外多糖精品 (EPS)。用葡萄糖為對照品,用苯酚-硫酸法測得粗多糖中多糖的含量為67.5%,精制多糖中多糖含量為 97.86%,糖含量測定的標準曲線見下圖 1。用牛血清白蛋白為對照品,用考馬斯亮藍法測得粗多糖中蛋白含量為20.8%,精制多糖中蛋白含量為 2.14%,蛋白質標準曲線見下圖 2。

2.2 E.cloacaeZ0206胞外多糖對 DPPH自由基的清除活性

EPS對 DPPH自由基的清除能力以清除率表示,清除率越高,說明該多糖抗氧化作用越強。EPS與Vc對DPPH自由基清除作用的試驗結果如圖 3所示。DPPH自由基是一種很穩定的以氮為中心的自由基,若受試物能清除它,則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基和過氧自由基的有效濃度和打斷脂質過氧化鏈反應的作用。DPPH自由基有個單電子,在 517 nm有強吸收,其乙醇溶液呈深紫色,加入受試物后,在 517 nm可以監測其對DPPH自由基清除效果。由圖3可見,EPS和Vc對DPPH自由基均有不同程度抑制作用,隨著濃度的增大 EPS和Vc清除能力接近,濃度 1.25 mg/mL時清除率已達54.49%,濃度為 5 mg/mL時,清除率達到 61.57%,這些結果說明EPS在一定濃度范圍內對DPPH自由基具有一定得清除活性。

圖 3 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對 DPPH自由基的清除能力(±s,n=5)Fig.3 Scavenging effects of EPS and Vc on DPPH radicals (±s,n=5)

2.3 E.cloacaeZ0206胞外多糖對羥自由基的清除活性

圖 4 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對·OH的清除能力(±s,n=5)Fig.4 Scavenging effects of EPS and Vc on hydroxyl free radicals(±s,n=5)

羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標。在反應體系中 H2O2和 Fe2+混合發生 Fenton反應,生產具有很高反應活性的·OH,其能被水楊酸有效的捕捉,并生成有色物質;但若加入具有清除作用的物質,便會與水楊酸競爭,從而使有色產物生成量減少。因而可用吸光值的變化來反映該多糖對·OH的清除能力。從圖 4可見,在 0.156～5 mg/ mL的有效濃度范圍內,隨著 EPS濃度的增加,其清除·OH的作用逐漸增強,在 5 mg/mL時對·OH的清除率達 40.08%。

2.4 E.cloacaeZ0206胞外多糖對超氧陰離子自由基的清除活性

超氧陰離子自由基是基態氧接受一個電子后形成的第一個氧自由基,可以經過一序列反應生成其它的氧自由基。多糖分子上均有還原性的半縮醛羥基,能與超氧陰離子自由基發生氧化還原反應,從而終止自由基鏈式反應。·清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標之一。EPS與 Vc對·自由基清除作用的試驗結果如圖 5所示,由圖 5可見, EPS對超氧陰離子自由基的清除能力相對較弱,在濃度為 5 mg/mL時,清除率僅為 13.68%。

圖 5 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對 ·的清除能力 (±s,n=5)Fig.5 Scavenging effects of EPS and Vc on superoxide anion free radicals(±s,n=5)

2.5 E.cloacaeZ0206胞外多糖的還原能力

抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的,還原力越強,抗氧化性越強。藥物還原力的大小在一定程度上反映了其預防性抗氧化功能的強弱。因此,可通過測定還原力來說明抗氧化活性的大小。EPS與 Vc的還原力的試驗結果如圖 6所示。從圖 6可見,在 0.156 mg/mL～5 mg/mL的有效濃度范圍內,隨著 EPS濃度的增加,還原力逐漸增強。當質量濃度為 0.156 mg/mL時,多糖的吸光值為 0.029;當質量濃度為 5 mg/mL時,多糖的吸光值為 0.535,提示 EPS濃度具有一定的還原能力。

已知自由基對 DNA、蛋白質、酶和脂質等生物分子具有氧化損傷作用,從而導致機體的衰老和多種病變[1]。抗氧化多糖的發現,與其他外源性抗氧化劑相比,抗氧化多糖具有低毒、安全來源廣等特點。作為外源性抗氧化劑,多糖在生物體內發揮作用更為復雜,它可直接參與催滅自由基的途徑外,還可能與通過調節機體內內源性抗氧化劑的活性相關[10,11]。多糖可以作為一種天然的生物抗氧化劑進行復配,增強人體健康的保護作用。但為最終獲得抗氧化活性高的目標化合物,為新藥或保健品的開發研究奠定理論基礎,還需要進一步開展體內生物功效以及抗氧化作用與其構效關系的研究[12]。目前對多糖的抗氧化活性研究一般采用體外模型,即以清除自由基的效率以及還原能力的大小等為檢測指標,從離體或整體水平上衡量多糖抗氧化作用的大小[13]。Wang等報道 1株成團泛菌 (Pantoea agglom erans)多糖對羥自由具有顯著的清除能力[14]。

EPS具有清除 DPPH自由基和羥自由基的作用,并且隨著糖濃度的增加,對DPPH和羥自由基的清除力增強,呈明顯的量效關系;對鄰苯三酚體系產生的·具有一定的清除作用,但清除率低于 Vc對超氧陰離子自由基的抑制作用。從其對幾種自由基的清除作用來看,EPS對DPPH自由基的清除作用最強,其對活性氧自由基的清除作用可能存在一定得選擇性。本實驗結果提示 EPS在體外對活性氧自由基均有清除作用,從而能夠清除體內產生的過多氧自由基,阻斷體內自由基反應鏈的作用,并在抗氧化劑抗衰老方面具有一定的作用,是一種很有開發潛力的抗氧化、防衰老的食品或藥物。當然,在后期的試驗中,將在結構表征的基礎上,通過細胞模型和動物模型對 EPS的體內外抗氧化活性做深入研究,以探究其構效關系,以為其開發利用奠定一定的基礎。

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Antioxidative Activity of Exopolysaccharide Produced byEnterobacter cloacaeZ0206

XU Chun-lan,Q IN Chuan-guang＊,N IU Wei-ning,SHANG Xiao-ya
Faculty of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China

The experiment was conducted to prepare exopolysaccharide(EPS)fromEnterobacter cloacaeZ0206 strain through fermentation and to evaluate its antioxidant activity.By determining the reducing capability,the scavenging effects of EPS on 1,1-diphenyl-2-picrylhy-drazyl(DPPH)radicals,superoxide anion free radicals,and hydroxyl radicals,the antioxidant activity of EPSwere evaluated.The results showed that the yield of EPSwas 6.62 g/L and the scavenging effects of EPSon theDPPH free radical and the hydroxyl radicals reached 61.57%and 40.08%at concentration of 5 mg/mL,respectively.The EPS exhibited obvious antioxidant activity and wasworthy of exploitation in future.

Enterobacter cloacae;exopolysaccharide;free radicals;antioxidant

1001-6880(2010)06-1098-05

2009-06-30 接受日期:2009-08-24

中國博士后科學基金 (20080440195)和西北工業大學科技創新基金(2008KJ02040)。

＊通訊作者 Tel:86-29-88491840,E-mail:lx304319@163.com

TS201.2

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