熊果酸誘導肝癌細胞HepG2凋亡的實驗研究

張 靜

(長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

熊果酸誘導肝癌細胞HepG2凋亡的實驗研究

張 靜

(長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

目的：探討熊果酸對肝癌細胞HepG2的增殖抑制和誘導凋亡作用及其機制。方法：運用體外細胞毒性實驗(MTT)檢測細胞的增殖；流式細胞術分析細胞周期和凋亡率；Western blot檢測HepG2細胞內細胞色素C(cytochrome c，cyt-c)、caspase-3的表達。結果：熊果酸對HepG2細胞具有抑制增殖和誘導凋亡作用，并呈濃度和時間依賴性；細胞主要阻滯在G0/G1期，S期細胞數減少；同時cyt-c釋放和caspase-3酶原活化增加。結論：熊果酸能夠在體外抑制肝癌細胞HepG2增殖并誘導其凋亡，而促進cyt-c釋放增加，引起caspase-3的活化可能是其作用機制之一。

熊果酸；HepG2；細胞色素C；Caspase-3

熊果酸(Ursolic acid，UA)，又名烏索酸、烏蘇酸，是一種五環三萜酸類化合物，在自然界中分布廣泛，如在熊果、枇杷葉、女貞子、山楂、車前子、夏枯草和白花蛇舌草等天然植物中。它具有抗炎、護肝、止痛、降血糖、調節中樞神經系統以及抗腫瘤等多種生物學效應[1]，其中最為突出的是抗腫瘤作用。研究發現，UA既能誘導腫瘤細胞凋亡，又能抑制正常細胞的惡變，有望成為抗腫瘤新藥。目前已證實它能通過多種機制誘導人乳腺癌細胞MGF-7、肺癌細胞A529、前列腺癌pc-3、胃癌細胞BGC-823和SGC、大腸癌細胞-HT29、子宮內膜癌SNG-Ⅱ等多種腫瘤細胞凋亡[2]；也能通過胞漿內糖皮質激素受體的移位下調人纖維肉瘤HT1080細胞MMP9基因的表達，從而降低腫瘤的侵襲力[3]。本研究用UA處理人肝癌細胞HepG2，觀察細胞內相關基因的改變，為熊果酸在抗腫瘤臨床應用及其作用機制的深入研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細胞株HepG2購自上海細胞所；RPMI-1640購自Gibco BRL公司；熊果酸、MTT、Hoechst33258熒光染料和PI染料均購自美國Sigma公司；鼠抗人cyt-c，caspase-3單抗購自Chemicon公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 用含10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養基于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞增殖抑制實驗 將對數生長期細胞濃度調整為2×104個/ml，每孔200l接種于96孔培養板，孵育24h后，每孔加入不同藥物濃度的UA使終濃度分別為20、40、60和80mol/L，每組設6個復孔；另設對照組(0mol/L)。分別于加藥后24，48和72h檢測細胞活動。細胞孵育終止前，每孔加入MTT使其終濃度為1mg/ml，4h后離心棄上清，每孔加入DMSO 100μl溶解結晶，混勻后置于酶標儀570nm波長處測光密度(D)。計算增殖抑制率IR(%)=[(1-實驗組光密度值)/對照組光密度值]×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期的改變 用終濃度40mol/L的UA作用HepG2細胞24，48，72h，同時設立對照組(0mol/L)。每組收集2×106個細胞，用冰預冷的70%乙醇固定12h；離心棄固定液，PBS重懸5min后300目篩網過濾；加入PI染液，4℃避光染色30min，流式細胞儀(Beckman)分析細胞周期及凋亡率。

1.2.4 Western blotting 分別用終濃度0，20，40，60和80mol/L UA作用于細胞48h，每組收集1×107個細胞；分別加入120μl蛋白裂解液在冰浴中裂解30min后，4℃離心并收集上清；取約25μl樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后取凝膠，于4℃下電流60mA轉印過夜至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1h后，依次加第一抗體鼠抗人cyt-c(鼠抗人caspase-3)單抗和第二抗體HRP-羊抗鼠(羊抗兔)IgG，各孵育1h，DAB顯色液顯色并攝像、保存。

2 結 果

2.1UA對HepG2細胞增殖的抑制作用UA呈劑量和時間依賴性的抑制肝癌HepG2細胞增殖(見表1)。20mol/L UA對HepG2細胞的增殖抑制作用相對較弱，而 80mol/L UA作用72h后，HepG2細胞幾乎停止增殖。

表1不同濃度UA抑制HepG2細胞增殖的動態作用

注：與對照組比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01。

2.2UA對細胞凋亡及細胞周期的影響經40mol/L UA作用24,48,72h后，隨著作用時間的延長，G0/G1期細胞的比例逐漸上升，S期細胞的比例逐漸下降，主要呈現G0/G1期阻滯，并存在時間依賴性。見表2。

表2 UA對HepG2細胞周期和凋亡率的影響 %

注：與對照組比較，*Plt;0.05。

2.3Westernblotting結果用20～80mol/L UA處理細胞48h后，隨著藥物濃度增加，細胞色素C(15kD)的蛋白條帶逐漸加深(見圖1)。還可以檢測到約caspase-3(32kD)酶原活化，棕黃色蛋白條帶逐漸變淺變細；而活化片段(17kD和19kD)的蛋白條帶顏色則逐漸加深(見圖2)。

1～5：0,20，40，60和80mol/L UA 1～5：0，20，40，60和80mol/L UA 圖1 Western blotting檢測UA作用后cyt-c表達 圖2 Western blotting檢測UA作用后caspase-3表達

3 討 論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居我國惡性腫瘤死亡率的第二位。雖然目前外科手術仍是治療肝癌的最有效手段，但適于手術切除的肝癌不足25%，而且術后5年生存率僅為40%[4]。因此，為肝癌患者尋找更多、更有效的治療手段變得越來越迫切。大量報道表明熊果酸具有廣泛的藥理作用，它能通過抑制腫瘤形成、細胞毒作用、生長抑制、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成以及增強免疫功能等多種機制來抑制腫瘤生長和擴散；而且其安全性能高、不良反應少，具有廣闊的開發應用前景，有望成為一種高效低毒的抗腫瘤新藥。

本實驗結果表明，UA對肝癌HepG2細胞具有明顯的增殖抑制和誘導凋亡作用，并呈濃度和時間依賴性。應用80mol/L熊果酸處理HepG2細胞72h后，其增殖抑制率最高達到89.22%。細胞周期分析發現UA主要將肝癌HepG2細胞阻滯在G0/G1期，而S期細胞逐漸減少。隨著作用時間的延長，UA阻滯細胞周期的作用逐漸增強, 呈顯著的時間依賴性。這一結果提示：熊果酸可能直接損傷DNA，通過阻滯細胞G0/G1期，使細胞堆積在DNA合成前期，無法進入DNA合成期，從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖。

近年來研究發現，caspases的蛋白酶級聯反應控制著凋亡的發生與發展[5]。Caspases級聯發應的激活主要通過兩條途徑：一條是外源性途徑[6]即死亡受體途徑，另一條是內源性途徑[7]即線粒體依賴途徑。本實驗主要是從線粒體依賴途徑方面研究。Western blotting的結果顯示，隨著熊果酸作用濃度的增加，細胞色素C的條帶顏色逐漸加深，說明其釋放量逐漸增多，同時我們還檢測到caspase-3酶原被活化，裂解成兩個活性片段(17kD和19kD)。我們認為，細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1(Apaf-1)結合，形成細胞色素C/Apaf-1復合體，該復合體可使無活性的caspase-9酶原發生自身活化，繼而形成細胞色素C/Apaf-1/caspase-9 復合體，此復合體繼續作用于下游的效應caspases如caspase-3等。活化的caspase-3可以作用于胞質中的細胞骨架蛋白，或作用于細胞核中的DNA酶,引起DNA斷裂，從而引發了HepG2細胞的凋亡[8]。

綜上所述，促進cyt-c的釋放，進一步激活caspase-3可能是熊果酸誘導細胞凋亡的作用機制之一，當然為了更加肯定這個結論，我們將在后續實驗中檢測caspase-9、Apaf-1等。但由于細胞凋亡是一個多系統、多階段參與的復雜過程[9]，熊果酸在體內對細胞凋亡的影響尚有待進一步研究。

[1]王婷，宋懷燕. 熊果酸藥理作用研究進展[J]. 中華醫學研究雜志，2005，5(9)：877-879.

[2] 海龍，蘇秀蘭，畢力夫. 熊果酸抗腫瘤機制研究進展[J]. 2008，15(11)：870-872.

[3] 張秋萍，謝珞琨，鄧濤，等. 熊果酸促進K562細胞凋亡[J]. 基礎醫學與臨床，2004，24(4)：414-417.

[4] 王輝，方全華，李海軍. 熊果酸誘導人肝癌BEL-7404細胞凋亡的作用及其機制[J]. 腫瘤基礎與臨床，2010，23(2)：93-95.

[5] Wei MC，Tullia L，Vamsi K，etal.tBID，membrane-targeted death ligand, oligomerizes BAK to release cytochrome c[J]. Denes Dev，2000， 14：2060-2071.

[6] Shou GZ，Mary CL, Irene EK. caspase-8 mediates caspase-3 activation and cytochrome c release during singlet oxygen-induced apoptosis of hl-60 cells[J]. Experimental Cell Research，1999，250(1)：203-212.

[7] Liu X，Kim CN，Yang J，etal. Induction of apoptotic program in cell free extract：Requirement for dATP and cytochrome C[J]. Cell，1996，86：147-157.

[8] 李振光，彭旭. 線粒體與細胞凋亡[J]. 基礎醫學與臨床，2001，21(5)：400-403.

[9] Oohyun S，Vladimir I，Qing X，etal.The effect of ursodeoxycholic acid on the survivin in thapsigargin-induced apoptosis[J]. Cancer Letters，2003，191：83-92.

[編輯] 一 凡

2010-11-20

張靜(1981-)，女，湖北沙市人，講師，碩士，從事分子生物學教學與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.04.002

R735.7

A

1673-1409(2010)04-R004-03