殼聚糖對異育銀鯽非特異性免疫功能的影響

曹志華，嚴(yán)書林， 羅靜波，余文斌

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

殼聚糖對異育銀鯽非特異性免疫功能的影響

曹志華，嚴(yán)書林， 羅靜波，余文斌

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為了解殼聚糖對魚類非特異性免疫機(jī)能的影響，以體重20.5～24.8 g的異育銀鯽為研究對象,在其飼料中分別添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g的殼聚糖,在23～25 ℃水溫下飼喂30 d后,分別測定各組魚的血清、脾臟、頭腎的溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性，以及肌肉、肝胰臟和血清的SOD活性。結(jié)果顯示，飼料中添加0.5～2 g/100 g的殼聚糖能顯著提高異育銀鯽的溶菌酶活性(Plt;0.05)和白細(xì)胞吞噬活性(Plt;0.05),而對SOD活性沒有明顯影響。

異育銀鯽；殼聚糖；非特異性免疫

抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病預(yù)防和治療中過度廣泛的使用，導(dǎo)致其負(fù)面作用越來越突出，因此免疫刺激物的研究越來越受到人們的重視。免疫刺激物如細(xì)菌多糖類、化學(xué)物質(zhì)及動植物提取物對魚類白細(xì)胞吞噬能力及溶菌酶的活性有關(guān)，它們可以增強(qiáng)魚類對多傳染性病原的非特異性免疫反應(yīng)，提高魚類的整體抗病力[1～5]。目前，關(guān)于甲殼素和殼聚糖的研究雖有報道，但主要是研究昆蟲殼聚糖對養(yǎng)殖魚類的影響，且結(jié)果也并不一致，因為殼聚糖的來源不同、分子量不同，其對抗病的影響也不一樣。

為了解殼聚糖對魚類免疫功能的影響，本研究從蝦殼中提取殼聚糖，以異育銀鯽為研究對象，探討了不同添加量的殼聚糖對異育銀鯽的溶菌酶活力、白細(xì)胞吞噬活性及SOD活性的影響，以期為殼聚糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試異育銀鯽來源于長江大學(xué)水產(chǎn)基地，體重為20.5～24.8 g，暫養(yǎng)1周后，挑選體色正常、體質(zhì)健壯、健康無病的個體用于試驗。

殼聚糖的制備參照文獻(xiàn)[1～4]。具體方法為：將收集的新鮮蝦殼,先去除蝦殼內(nèi)外表面的異物,然后經(jīng)脫鈣、脫色等工序制成甲殼素,其工藝流程為:蟹殼→水洗→堿浸→水洗→酸泡→脫色→水洗→干燥→粉碎→成品。再將甲殼素與氫氧化鈉溶液在三口燒瓶中混合攪拌,在一定溫度下回流一定時間后,過濾、洗滌、烘干，產(chǎn)物即為殼聚糖。經(jīng)測定，其殼聚糖含量為40.33 g/100 g、蛋白質(zhì)含量32.06 g/100 g 、粗脂肪含量0.99 g/100 g、 鈣含量10.74 g/100 g。

1.2 試驗方法

試驗魚共分6組(Ⅰ～Ⅵ)，分別飼養(yǎng)在55 cm×35 cm×45 cm的水箱中，每組3個平行，共18個水箱，每箱放30尾，分別飼喂對應(yīng)組別飼料。各組試驗飼料分別添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g的殼聚糖，其配方詳見表1。

飼養(yǎng)期間使水溫控制在23～25 ℃，充氣泵間歇增氧(每隔45 min增氧10 min)。按體重2%～3%每天投喂飼料2次。1 h后清除箱中的污物，并換掉箱中2/3的水，飼養(yǎng)30 d。

1.3 白細(xì)胞吞噬活性的測定

將金黃色葡萄球菌接種在液體肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)48 h，離心集菌，加入濃度為1%的福爾馬林37 ℃滅活24 h，用滅菌生理鹽水清洗并稀釋至一定濃度，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.0×108個/mL，保存于40 ℃冰箱中備用。在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL 1.0×108個/mL 的金黃色葡萄球菌液，搖勻后放在28 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，2 000 r/min離心15 min，用吸管吸取紅細(xì)胞與血漿交界的白細(xì)胞層制涂片干燥，甲醇固定3 min,姬姆薩染色2 h。每尾魚的抗凝血制作5張涂片，每張涂片在油鏡下計數(shù)100個白細(xì)胞，以下式計算吞噬百分比和吞噬指數(shù)

表1 各組飼料原料組成Table 1 Ingredients compositions of the experimental diets g/100 g

注：各組飼料原料粉碎后過60目篩,微量成分采取逐級擴(kuò)大法添加與大原料混合均勻后,用螺桿制粒機(jī)擠壓成型,風(fēng)干后放入冰箱中冷凍備用。

吞噬百分比(PP，%)=(參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)÷100個白細(xì)胞)×100

吞噬指數(shù)(PI)=100個白細(xì)胞內(nèi)吞噬菌體總數(shù)/吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)

1.4 溶菌酶活性的測定

以3尾魚為1組，斷尾采血，加至5 mL離心管中，靜置，冰箱中保存24 h，血清析出備用。取完血的魚用剪刀沿腹中線剪開，取出魚的脾臟和頭腎，分別加入pH 6.5、5倍體積的0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液，在冰水中勻漿，以1 000 r/min勻漿10 min，取上清液備用。以溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)凍干粉為底物，用0.1 mol/L，pH 6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成底物懸液(光密度D570 nm≈0.3)。取3 mL該懸液于試管內(nèi)置冰浴中，加入50 μL待測液混勻，測其光密度D0。然后將試液移入37 ℃ 溫浴中30 min,取出后立即再置于冰浴中10 min以終止反應(yīng)，測其光密度D。溶菌酶活性UL按下式計算：UL=(D0-D)/D

1.5 SOD活性的測定

異育銀鯽的肌肉、肝胰臟和血清的SOD活性采用南京建成生物有限公司的試劑盒進(jìn)行測定，其活性單位定義為：每毫升血清或每毫克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個酶活力單位(U/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對異育銀鯽抗病力的影響

飼喂30 d后,殼聚糖對異育銀鯽白細(xì)胞吞噬活性和溶菌酶活性有顯著影響(表2)，與對照組相比，殼聚糖添加量在0.5～2.0 g/100 g的范圍內(nèi)，白細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)都有顯著差異(Plt;0.05)，血清溶菌酶和脾臟溶菌酶活性也有顯著差異(Plt;0.05)，但頭腎溶菌酶活性在添加0.5 g/100 g的殼聚糖組與對照組和2.5 g/100 g添加組沒有顯著差異(Pgt;0.05)。

表2 殼聚糖對異育銀鯽抗病力相關(guān)因子的影響Table 2 Effect of chotisan on factors related to anti-disease of allogyogenetics silver crucian carp

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表明組間差異顯著(Plt;0.05 )。

2.2 殼聚糖對異育銀鯽SOD活性的影響

表3 殼聚糖對異育銀鯽肌肉，肝胰腺及血清中SOD活性的影響Table 3 Effect of chotisan on SOD activity in muscle，hepatopancrea and serum of allogyogenetics silver crucian carp

飼料中添加殼聚糖對異育銀鯽肌肉、肝胰臟和血清中SOD活性沒有顯著影響(表3)。不添加殼聚糖，組織中SOD活性依次為肝胰臟gt;血清gt;肌肉。添加殼聚糖后，雖然隨著添加量的增加，SOD活性有下降的趨勢，但各組之間沒有明顯差異(Pgt;0.05)。

3 討論

動物體內(nèi)的吞噬細(xì)胞在吞噬消化病原生物的同時，可以保留抗原信息，并將其傳遞給有關(guān)的淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。溶菌酶是淋巴細(xì)胞分泌的堿性溶解酶，主要做用于革蘭氏陽性菌及某些特定細(xì)菌的細(xì)胞壁的粘多糖，當(dāng)機(jī)體遭到病原攻擊時，白細(xì)胞的吞噬作用加強(qiáng)，也使溶菌酶的活性增加[5]。王樹芹等[6]的試驗結(jié)果表明，殼聚糖能提高白細(xì)胞的吞噬能力和溶菌酶的活性，但隨著添加量的增加，會出現(xiàn)免疫疲勞現(xiàn)象。本研究結(jié)果也表明，添加適量的殼聚糖能提高白細(xì)胞的吞噬活性和溶菌酶的活性。雖然隨著添加量的增加(0.5～2.0 g/100 g)，白細(xì)胞的吞噬活性和溶菌酶活性比較穩(wěn)定但均明顯高于對照組，但當(dāng)添加量達(dá)到2.5 g/100 g時，白細(xì)胞的吞噬活性和溶菌酶的活性反而出現(xiàn)下降，所以在本研究認(rèn)為殼聚糖的最適添加量應(yīng)為0.5～2.0 g/100 g。這個范圍與有些研究結(jié)果[6～8]不符，他們的研究認(rèn)為殼聚糖的添加量為0.5 g/100 g效果最好。產(chǎn)生這樣差異的原因可能與殼聚糖的來源不同有關(guān)，本研究使用的殼聚糖系從蝦殼中提取，其純度和和成分與之相比可能有所不同。

SOD是關(guān)鍵的抗氧化酶之一,它可以清除體內(nèi)多余的自由基,使自由基的形成與消除處于一種動態(tài)平衡中,免除其對生物分子的損傷。有研究表明，SOD活性與生物的免疫水平呈密切相關(guān)[9]。因此，SOD可作為機(jī)體非特異性免疫指標(biāo),來評判免疫刺激劑對機(jī)體非特異性免疫力的影響。本研究結(jié)果表明，對照組各組織中SOD活性不同,其中以肝胰腺和血清含量較高，肌肉的相對較低。添加殼聚糖對SOD的活性沒有產(chǎn)生明顯影響，雖然隨著殼聚糖添加量的增加，其活性有逐步下降的趨勢，但差異并不顯著。

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2010-05-25

曹志華(1966-)，女，湖北監(jiān)利人，農(nóng)學(xué)碩士，副教授,主要從事動物營養(yǎng)研究..

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.011

S942.1

A

1673-1409(2010)02-S029-03