育珠蚌不同組織基因組DNA提取質量比較

彭本英，金 敏，章 樂，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

育珠蚌不同組織基因組DNA提取質量比較

彭本英，金 敏，章 樂，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

利用飽和酚-氯仿法分別提取了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)6個組織斧足、鰓、閉殼肌、性腺、肝臟、心臟中的基因組DNA，并采用紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴增法分析了三角帆蚌不同組織基因組DNA的提取效果。結果表明：三角帆蚌6個組織均能成功地提取基因組DNA，但6個組織提取的DNA質量存在差異，斧足中提取的DNA純度、濃度最高，PCR擴增條帶最亮，因而是三角帆蚌提取DNA的最佳組織，其次為斧足和閉殼肌、心臟和性腺提取的DNA較差。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)；基因組DNA；組織；提取質量

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國淡水珍珠養殖主要蚌源，養殖歷史悠久、產量高、成珠質量好。隨著珍珠養殖的不斷深入，由于不規范的增養殖措施，如使用近源親本、苗種培育不科學、忽視養殖病害等[1]，使得三角帆蚌種質退化、育珠期縮短、產珠質量明顯下降。為防止三角帆蚌種質退化，提高三角帆蚌產珠性能，保證淡水珍珠的品質，利用分子生物學手段對三角帆蚌的遺傳多樣性和群體親緣關系進行分析，為選種、育種提供基礎數據是非常必要和極其重要的。DNA提取是進行相關研究工作的基礎，對三角帆蚌分子生物學研究具有重要參考價值。目前關于三角帆蚌基因組DNA已有研究[2，3]，但尚無對各個組織DNA提取效果進行比較的報道。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理

2008年7月28日在湖北省荊州市江陵縣采集三角帆蚌10只，將蚌放入清水中暫養1周。解剖三角帆蚌，分別取斧足、心臟、鰓、閉殼肌、肝臟、性腺等6個組織，用滅菌的剪刀將各個組織剪成小塊，稱取重均為(20±2) mg的組織，用于基因組DNA的提取。分別取3只蚌的6個組織設置平行試驗組。

1.2 樣本DNA的提取

將三角帆蚌各個組織分別置于2 mL勻漿器中，加入540 μL HB(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L EDTA)，在冰上將各個組織充分勻碎后，將所有液體吸入2 mL EP管中，加入60 μL 10% 十二烷基磺酸鈉和20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，于55 ℃水浴鍋中消化至裂解液變澄清。

裂解液分別用等體積的酚∶ 氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，加入2倍體積的無水乙醇離心沉淀DNA，用70%的乙醇清洗2次后置于濾紙上晾干，加入50 μL TE緩沖液(pH 8.0)，4 ℃冰箱放置過夜，讓DNA充分溶解。

1.3 DNA純度、濃度及得率的計算

取適量DNA稀釋后，以TE為對照，在德國Eppendorf分光光度儀(BioPhotometer)上測定其在260 nm、280 nm和230 nm波長處的光密度。DNA的純度可以從D260/D280比值來判斷。按下述公式分別計算DNA濃度和得率：DNA濃度(μg/μL)=D260×n(稀釋倍數)×50 (μg/mL)÷1 000；得率(μg/g)=DNA量(μg)/樣品量(g)。

1.4 DNA的PCR擴增

選用三角帆蚌的看家基因β-actin對所提取的DNA進行PCR擴增，檢測DNA提取效果。PCR反應條件為：94 °C預變性5 min后；按照94 °C變性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸1.0 min的循環參數運行25個循環；最后72 °C延伸10 min終止反應。反應體積20 μL，組成如下：5 ng DNA模板，10 μmol引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Blend Taq酶 (Fermentas公司) 0.25 μL，補足H2O 至20 μL。PCR產物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離。用凝膠成像系統(White/Ultraviolet Transilluminator GDS8000型，UVP公司)記錄擴增產物條帶。

三角帆蚌β-actin引物為武漢博杰公司合成，序列為：F/R： CCGTGTTTCCATCCATCGT/CAGGACTGGGTGCTCTTCA。

1.5 數據處理

采用Statistica統計軟件中Duncan’s多重比較進行差異顯著性檢驗，結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 三角帆蚌不同組織DNA提取電泳結果

1:λ DNA Hind Ⅲ/Kpn Ⅰ 雙酶切(bp)；2～4:斧足；5～7:鰓；8～10:閉殼肌；11～13:性腺；14～16:肝臟；17～19:心臟圖1 三角帆蚌不同組織DNA提取效果電泳圖Figure 1 DNA Electrophoresis in different tissues of Hyriopsis cumingii

三角帆蚌斧足、鰓、閉殼肌、性腺、肝臟和心臟等6個組織均能提取較高質量的DNA，其中以斧足的提取效果最好，基因組DNA很完整，無拖尾現象，且濃度較高。性腺組織提取的DNA也無拖尾現象，但DNA的亮度較低。鰓、閉殼肌、肝臟和心臟等4個組織提取的DNA均有拖尾現象出現(圖1)。

2.2 不同組織DNA純度和得率比較

三角帆蚌6個組織提取的基因組DNA的純度均較高，6個組織所測DNA的D260/D280值均在1.8～2.0之間。但不同的組織提取的基因組DNA濃度存在明顯地差異，其中肝臟、心臟、斧足和閉殼肌等4個組織提取的DNA濃度較高，鰓和性腺中DNA濃度較低(表1)。

表1 三角帆蚌不同組織基因組DNA 純度和得率比較Table 1 Extraction DNA purity and extraction rate in different tissues of Hyriopsis cumingii

注：同行不同小寫字母表示組織間差異顯著(Plt;0.05)。

1:斧足；2:性腺；3:心臟；4:肝臟；5:鰓；6:閉殼肌；7:DL 2000 Marker圖2 三角帆蚌不同組織基因組DNA PCR擴增效果比較Figure 2 PCR amplification comparison in DNA extractraion from different tissues of Hyriopsis cumingii

2.3 不同組織DNA的PCR擴增效果比較

將三角帆蚌不同組織所提取的DNA稀釋為10 ng/μL作為模板進行PCR擴增，每個反應取模板量為0.5 μL。利用三角帆蚌看家基因β-actin對所有組織所提取的DNA進行PCR擴增，結果顯示如圖2。β-actin目的片段為227 bp。在所有6個組織中均能檢測到β-actin的目的條帶，但肝臟和斧足中條帶最亮，其次為閉殼肌，鰓、性腺和心臟的條帶較弱。

3 討論

生物體組織細胞中的脫氧核糖核酸(DNA)部分與蛋白質結合，以核蛋白-脫氧核糖核蛋白(DNP)的形式存在。平衡酚-氯仿法是利用SDS裂解細胞，蛋白酶K消化大部分蛋白質，最后用酚+氯仿+異戊醇除去剩余的蛋白質。如果提取的DNA中含有蛋白質污染會影響后續的試驗，因而采用酚+氯仿+異戊醇2次抽提的方法盡可能將其中的蛋白質除去干凈。此外，考慮到軟體動物斧足內部結構堅硬，蛋白質含量高[4]，因而相對于劉瑾等[3]所描述的提取三角帆蚌基因組DNA的4種方法(苯酚法、改進苯酚法、CTAB法和改進ROSE法)來說，本研究采用的平衡酚-氯仿法增加1倍的蛋白酶K的加入量，電泳結果以及分光光度計測定的D260/D280結果表明，這種方法達到了較好的效果，各個組織所提取的DNA中基本無蛋白污染。此外，本研究不需要液氮，方便于一般的實驗室操作。

目前在利用軟體動物雙殼類提取基因組DNA時，最常選擇的組織是肌肉。如包永波等[4]用西施舌的斧足提取基因組DNA；劉瑾等[3]用三角帆蚌的斧足提取DNA；於瓊維等[2]用褶紋冠蚌的閉殼肌提取DNA。一方面是由于這2個組織取樣很容易，另一方面，本研究中三角帆蚌6個組織基因組DNA的提取效果比較顯示，斧足DNA的電泳圖譜完整、無拖尾現象、DNA純度和濃度高、PCR擴增條帶亮。因而三角帆蚌提取基因組DNA的最佳組織為斧足。雖然三角帆蚌閉殼肌提取的DNA純度和濃度均較高，但電泳圖譜中有少量拖尾現象，且PCR擴增條帶也不是很亮，因而閉殼肌不是三角帆蚌提取DNA最適材料。肝臟是脊椎動物常用的提取基因組DNA材料[5，6]，軟體動物是無脊椎動物中唯一具有肝臟的動物。利用三角帆蚌肝臟提取基因組DNA雖然電泳顯示有少許的拖尾，但分光光度計測定的結果表明其純度和濃度均較高，PCR擴增的條帶也很亮。三角帆蚌的肝臟是位于膨大的胃周圍、褐色的消化腺。由于貝類的斧足和閉殼肌在勻漿的過程中很難完全勻碎，相對來說肝臟的勻漿就容易得多，因而肝臟也非常適合作為三角帆蚌提取DNA的材料。而三角帆蚌性腺和心臟無論是從電泳圖譜、純度、濃度還是PCR擴增來看提取的DNA均不是很好，而且非專業人員不能夠正確地判斷2種組織并對其取樣，因而不建議利用這2種組織來提取DNA。

對于從基因組DNA上擴增大片段基因(例如gt;10 kb的基因)的實驗來說，要求提取的DNA盡可能完整、斷裂少、大部分DNA保持長的雙鏈。因而在提取基因組DNA抽提的過程中搖蕩液體動作要輕緩，轉移液體的過程中吸樣及放樣動作要緩慢，且盡可能采用剪頭滅菌的槍頭。

[1]溪 流. 我國淡水珍珠業面臨的問題 [J]. 現代漁業信息，2006，21(9):36.

[2]於瓊維，楊受保，弭忠祥. 一種無液氮的育珠蚌基因組DNA提取方法 [J]. 水利漁業，2006，26(2):15～16.

[3]劉 瑾，舒妙安. 三角帆蚌基因組DNA提取方法的比較研究 [J]. 水利漁業，2008，28(4):43～45.

[4]包永波，尤仲杰，焦海鋒. 西施舌基因組DNA的提取及其RAPD反應條件的優化[J]. 水利漁業，2005，25(6):32～33.

[5]范武江，王曉清，楊品紅，等. 鳙魚不同組織基因組DNA提取方法的探討 [J]. 南方水產，2007，3(1):44～47.

[6]劉 臻，魯雙慶，肖調義，等. 鯽魚基因組DNA提取方法的探討 [J]. 水利漁業，2004，24(6):20～22.

2010-01-12

湖北省自然科學基金項目(2008CDB104);湖北省教育廳資助項目(Q20081204)

彭本英(1968-)，女，湖北荊州人，助理實驗師，研究方向為動物分子免疫學.

許巧情，E-mail:xuqiaoqing@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.014

Q75;Q959.215

A

1673-1409(2010)02-S041-03