秈稻胚乳特異性啟動子Gt1的克隆及其功能驗證

劉 峰

趙伊英

(石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

鄭金貴

(農業部海峽兩岸農業技術合作中心，福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

秈稻胚乳特異性啟動子Gt1的克隆及其功能驗證

趙伊英

(石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

鄭金貴

(農業部海峽兩岸農業技術合作中心，福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

從秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)品種谷稈兩用稻‘東南201’中克隆獲得胚乳特異性啟動子Gt1；序列全長為929 bp；含胚乳中特異表達所必需的正調控元件GCN4 motif(TGAGTCA)與Skn-1 motif(GTCAT)等。與已報道的粳稻品種‘日本晴’的序列相比，秈稻‘東南201’Gt1啟動子序列僅在-507 bp處發生一個堿基突變，在-268、-267、-194、-193 bp位置處分別缺失1個堿基；但在已知功能motif，兩者沒有任何差異。用Gt1替代35SCaMV啟動子驅動GUS基因轉化水稻‘臺粳9號’，結果表明GUS基因僅在胚乳中特異表達，而在其它組織中未表達。克隆的秈稻谷蛋白基因Gt1的啟動子序列，可為進一步開展水稻品質分子改良提供必要手段。

胚乳特異性啟動子；秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)；轉基因

啟動子是基因表達所必需的，其決定了外源基因在轉基因植物中表達的空間、時間和表達的強度等，是人們定向改造生物的重要限制因素[1]。目前在植物表達載體中廣泛應用的啟動子是組成型啟動子。然而，由于組成型啟動子驅動外源基因在受體植物內所有部位持續的表達，不僅造成浪費，而且往往會影響植株正常的生長發育[2]。組織特異型啟動子可將外源基因集中在某一時間和/或目標組織中表達，不僅可避免因在轉基因植株非目標組織中表達所造成的能量浪費，而且也可避免因在非收獲器官或組織中表達目標蛋白而造成的轉基因食品的潛在不安全性等[3～7]。因此，組織特異性啟動子不僅有助于闡明植物形態、發育、代謝途徑等基礎理論，而且具有廣泛的應用價值。胚乳特異型啟動子是組織特異型啟動子的一種，它可以控制外源基因在植物胚乳中高效表達，避免外源基因在植物的其他部位表達，從而減少對植物的不利影響。水稻種子(胚乳)中的蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白組成；其中谷蛋白占種子貯存蛋白的70%～80%[8]。因此，以水稻為材料，從水稻谷蛋白基因Gt1的上游序列克隆出胚乳特異性啟動子，對利用胚乳特異性啟動子控制外源基因在水稻胚乳中特異表達具有重要理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)品種‘東南201’為克隆啟動子的實驗材料，是農業部海峽兩岸農業技術合作中心選育的優質特種谷稈兩用稻。粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)品種‘臺粳9號’為水稻轉化材料。

1.2 菌種、質粒與主要試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；質粒載體pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121由筆者所在實驗室保存提供；克隆載體pMD18-T、ExTaq酶、各種限制性內切酶、T4DNA連接酶等購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司。

1.3 秈稻‘東南201’基因組DNA的提取及PCR法獲得目標片段

采用百泰克生物工程公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取‘東南201’的基因組DNA；以Takaiwa等[9]報道的粳稻品種‘日本晴’的Gt1序列為基礎設計出一對特異性引物(劃線部位為增加的HindIII與BamH Ⅰ酶切位點)：

G-P1:5’-GCGAAGCTTAGGTCATAGGGAGAGGGAGCT-3’

HindⅢ

G-P2:5’-GGCGGATCCGTTGTTGTAGGACTAATGAACTGAATG-3’

BamHⅠ

以獲得的基因組DNA為模板進行PCR反應；擴增條件為94 ℃ 5 min，35個循環(94 ℃ 1 min，56 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min。PCR產物膠回收操作步驟參照百泰克生物公司多功能DNA純化回收試劑盒的說明進行。參照TaKaRa公司pMD18-T Vector試劑盒的說明將目的片段連接到pMD18-T Vector上，并轉化大腸桿菌DH5α，篩選抗Amp菌落，同時進行菌落PCR鑒定和測序；并命名為pMD-Gt1。

1.4 載體構建和水稻遺傳轉化

利用DNA重組實驗技術[10]構建質粒載體。用HindⅢ與BamHⅠ雙酶切質粒載體pMD-Gt1，回收小片段(Gt1序列)；同樣，用HindⅢ、BamHⅠ雙酶切質粒載體pBI121，回收大片段。再將回收的小片段和大片段進行定向連接獲得含Gt1序列與GUS基因的表達載體pBI121-Gt1。再用HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切質粒載體pBI121-Gt1，回收小片段；與此同時，HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切質粒載體pCAMBIA1300，回收大片段。再將此次回收的小片段和大片段進行定向連接獲得含Gt1序列與GUS基因的水稻表達載體p1300-Gt1-GUS。采用凍融法將質粒p1300-Gt1-GUS導入根癌農桿菌EHA105中。與此同時，表達載體pCAMBIA1301也直接被導入另外的根癌農桿菌EHA105中，用來作為對比研究。限制性內切酶酶切及連接反應的反應體系、反應時間等均參照TaKaRa公司產品使用說明進行。

水稻遺傳轉化基本培養基為NB培養基[11]；取授粉后10～15 d左右的未成熟‘臺粳9號’種子去殼后，于超凈工作臺，經70%的乙醇表面消毒1 min后，再用2% NaClO消毒28 min，無菌水漂洗4～5次，用解剖針挑出幼胚并接種于誘導培養基，Parafilm封嚴，26 ℃，暗培養。每16～18 d繼代1次，繼代3～6次的胚性愈傷組織用于農桿菌轉化。愈傷組織轉化、篩選、抗性愈傷分化及生根參照本課題組前期的研究[12]。

1.5 轉基因水稻的PCR檢測

使用百泰克生物工程公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取轉化的‘臺粳9號’植株的基因組DNA；設計特異性引物對：GUS-F:5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’；GUS-R:5’-GCGTCGCAGAACATTACA-3’，其擴增GUS基因部分序列(680 bp)；進行PCR 檢測。

1.6 GUS檢測方法

采用組織化學染色法檢測GUS在水稻組織細胞中的表達。取轉化水稻植株不同部位的材料至小離心管中，加入適量GUS染色液(50 mmol/L PBS,pH 7.0；0.5 mol/L X-Gluc；50 mmol/L potassium ferricyanide；50 mmol/L potassium ferrocyanide；10 mmol/L EDTA、0.001% Triton X-100以及20%甲醇)。于37 ℃保溫1 h至過夜；然后轉入70%乙醇中脫色后觀察。

1～3：水稻植株的PCR特異性擴增；4：DL 2000 Marker圖1 PCR擴增全長秈稻‘東南201’胚乳特異性啟動子序列Figure 1 Specific PCR amplification for Gt1 promoter sequence of “DN201”,an indica variety

2 結果與分析

2.1 胚乳特異性啟動子的克隆與序列分析

應用植物基因組提取試劑盒提取秈稻品種‘東南201’葉片基因組DNA，PCR擴增產物電泳顯示約在1 000 bp左右出現特異性條帶(圖1)。采用T-A克隆方法將PCR產物與pMD18-T連接、轉化，獲得重組質粒，命名為pMD-Gt；陽性克隆測序表明，片段全長為929 bp(圖2)，其中包括35個核苷酸的5’UTR序列。對序列 motifs分析表明，克隆到的秈稻Gt1啟動子核苷酸序列中含有在胚乳中特異表達所必需的正調控元件GCN4 motif(TGAGTCA)，Skn-1 motif(GTCAT)，序列上游-31 bp處包含一個TATA box(TATAAA)、-231 bp處包含一個核糖體結合位點(RBS：AGGAGG)；此外該序列還包含2個TAAATG motif(TAAATG)、1個CAC motif(CACCC)。該序列中不含有CAAT box(CCAAT)，這也與Takaiwa等[9]報道的粳稻品種‘日本晴(Nipponbare)’的研究一致。

與Takaiwa等[9]在粳稻品種‘日本晴’的研究的序列相比，兩者的一致性達99%；克隆的秈稻品種‘東南201’啟動子的片段僅在-507 bp處發生一個堿基突變；在-268 bp、-267 bp、-194 bp、-193 bp位置處分別缺失1個堿基。但在已知功能區(motifs)秈稻‘東南201’與粳稻‘日本晴’沒有差異。從秈稻品種‘東南201’中克隆獲得的胚乳特異性啟動子Gt1的全長序列已在GenBank 登錄，登錄號為EU441217。

Skn-1 motif:胚乳中特異表達所必需的正調控元件:GCN4 motif:胚乳特異性表達的順式調控元件；下劃線或粗體標出的分別為TATA 盒(TATAAA)，RBS(AGGAGG)，基序TAAATG(TAAATG)與CAC(CACCC)等；克隆獲得的胚乳特異性啟動子Gt1的全長序列已在GenBank 登錄，登錄號為EU441217。圖 2 克隆的秈稻‘東南201’(DN201)Gt1與粳稻‘日本晴’(RBQ)的Gt1序列比較Figure 2 Sequence comparison of Gt1 promoter from indica-type rice “DN201” and Gt1 promoter from japonica-type “Nipponbare”

2.2 轉化植株的分子檢測

使用分別含有p1300-Gt1-GUS及pCAMBIA1301表達載體(圖3)的農桿菌EHA105分別轉化水稻胚性愈傷，都獲得轉化植株。對轉化植株GUS基因進行PCR擴增，結果表明，從轉化植株擴增獲得預期的680 bp的目的基因片段，而未轉化的原品種未擴增出任何片段(圖4)。

35Spro:35S啟動因子;HPT:潮霉素選擇標記基因;TpolyA:tpolyA終止子:RB:左邊界;LB:左邊界;Gt1:從燦稻品種“東南201”中克隆獲得的胚乳特異性啟動子圖3 水稻高效表達載體pCAMBIA1301與p1300-Gt1-GUS的T-DNA區Figure3 SchematicrepresentationofpCAMBIA1301andp1300-Gt1-GUSexpressioncassettesusedforricetransformation1:DL2000Marker;2～3:pCABIA1301轉化獲得的植株;4～6:P1300-Gt1-GuS轉化獲得的植株;7:非轉化對照植株;8:質粒p1300-Gt1-GuS圖4 水稻植株葉片PCR檢測GUS基因Figure4 DetectionofGUSgeneincontrol-andtransgenicriceleavesbyPCR

2.3 轉GUS基因的水稻植株的GUS檢測

為了確證所克隆的啟動子的功能，取轉基因植株不同部位的組織進行GUS檢測。對水稻植株的根、莖、葉片、種子等組織的GUS檢測結果表明，轉p1300-Gt1-GUS表達載體的植株的GUS基因只在胚乳中特異性表達(圖5)，其它組織染色均為陰性；而轉pCAMBIA1301表達載體的植株在35SCaMV啟動子作用下，GUS染色均為陽性。由此可以確認，Gt1為胚乳特異性表達啟動子。

1:非轉基因原水稻品種；2:轉pCAMBIA1301水稻植株；3:轉p1300-Gt1-GUS水稻植株圖5 胚乳特異性啟動子驅動GUS基因在‘臺粳9號’胚乳中特異性表達Figure 5 The endosperm-specific expression of GUS gene driven by Gt1 promoter in rice ‘Taijing No.9’

3 討論

近年來，利用胚乳特異性啟動子驅動外源基因表達，進而改良水稻品質的研究越來越得到人們的重視。轉基因育種研究中，利用具有特異性表達特性的啟動子被認為是實現對目標基因高表達的重要途徑，也是培育高效、安全轉基因作物的首選[4]。Gt1啟動子能有效啟動目標基因在水稻胚乳中表達，以其作為啟動子已先后獲得了能降低血清膽固醇作用的“大豆米”(Soy-rice)[13]、可預防貧血的“鐵蛋白米”(Ferritin rice)[14]和“高鐵米”(Iron-rich rice)[15]等。

本研究克隆獲得的秈稻‘東南201’谷蛋白基因的5’端啟動子序列，與Takaiwa等[9]報道的序列共有5個堿基的差異。Takaiwa等[9]獲得的序列是對日本粳稻品種‘日本晴(Nipponbare)’基因組DNA分析的結果，而本研究用的是秈稻品種‘東南201’。不同類型或品種間在同一個基因的啟動子序列有可能存在一定的差異。然而對序列motifs分析表明，就重要功能區域來說，秈稻‘東南201’與粳稻‘日本晴’沒有差異，兩者具有相同的在胚乳中特異表達所必需的正調控元件、motifs等；這也說明生物體在進化過程中功能區域的高度保守性，不會因為環境等因素的變化而改變其遺傳性。

轉化植株經PCR鑒定GUS基因存在的情況下，用X-Gluc檢測液對GUS基因表達的情況進行鑒定，從而驗證了該啟動子的功能。轉基因表達要求具有經濟有效的高水平的重組蛋白表達體系；植物種類繁多，遺傳多樣性豐富，植物基因的啟動子和調控序列類型也多種多樣，利用能在宿主體內高效表達的特異性啟動子是提高外源基因在植物體內表達的一個有效途徑。本研究克隆了秈稻谷蛋白基因Gt1的啟動子序列，并證明其能引導GUS基因在胚乳進行組織特異性表達；這為我們進一步開展水稻品質分子改良提供重要手段。

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2009-05-27

國家自然科學基金(30671276)；國家轉基因重大專項(2009ZX08001-032B)；福建省自然科學基金項目(2009J01058)

劉 峰(1976-)，男，河南固始人，理學博士，副研究員，主要從事品質生物技術研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.015

S188

A

1673-1409(2010)02-S044-05