一個玉米逆境響應基因ZmSPK1表達載體的構建及擬南芥轉化

鄒華文

李翠花，吳啟俠

(長江大學農學院，湖北 荊州 434025)

一個玉米逆境響應基因ZmSPK1表達載體的構建及擬南芥轉化

李翠花，吳啟俠

(長江大學農學院，湖北 荊州 434025)

首次在玉米(ZeamaysL.)中克隆了1個SnRK家族基因，命名為ZmSPK1。為了研究ZmSPK1的功能,把ZmSPK1的cDNA 連接到植物表達載體pGreen0029中，通過農桿菌介導轉入擬南芥(Arabidopsis)中進行過量表達。PCR及Western-blot分析表明，ZmSPK1已經轉入到擬南芥中，并且在大多數轉化植株中穩定表達。

玉米(ZeamaysL.)；SnRK；ZmSPK1；擬南芥(Arabidopsis)

植物中的SnRK1蛋白激酶家族在響應逆境脅迫過程中起到了非常重要的作用。SNF1(sucrose non-fermenting-1)蛋白激酶家族包括酵母中的SNF1，哺乳動物的AMPK(AMP-activated protein kinase)以及高等植物中的SnRK，與CDPK親緣關系較近，同屬于CaMK組。在酵母中SNF1響應細胞內低葡萄糖信號，并且對被葡萄糖抑制的基因的解除抑制作用是必須的，SNF1還可以直接調節許多代謝酶的磷酸化水平[1,2]。AMPK可以在高的AMP/ATP狀態下被AMP激活，同時也可以被它的上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase kinase (AMPKK)所激活。有資料表明，活化的AMPK可以對哺乳動物細胞對不同逆境條件做出響應[3～5]。近年來的研究發現，高等植物細胞中一些SnRKs序列與酵母和哺乳動物中的SNF1有很高的同源性暗示了它們在功能上的相似性[6]。植物中已經鑒定了3個SnRK亞家族，分別是SnRK1，SnRK2和SnRK3。其中SnRK1與SNF1/AMPK家族具有直接的結構和功能同源性[6]，與SnRK1相比，SnRK2和SnRK3與SNF1/AMPK在序列上的相似程度較低，是植物所特有的，并且可能參與植物對逆境的脅迫反應。

SnRK2是一個相對較小的植物專一性基因家族，最近研究表明它們是受滲透脅迫激活的蛋白激酶。與SnRK1相比,SnRK2亞家族含有一個相對較短的C-端,C-端的一個顯著特征是其中含有一個短的酸性 “補丁” 。根據對被克隆成員的遺傳距離分析，表明SnRK2可以被分為2組：SnRK2a 和 SnRK2b。其中SnRK2a 組成員的酸性“補丁”中富含氨基酸Asp；而SnRK2 組成員的酸性“補丁”中富含氨基酸Glu[6]。

Kobayashi等[7]和Boudsocq等[8]分別對水稻和擬南芥基因組中的所有SnRK2成員進行了系統的生化研究。Kobayashi等[7]發現水稻基因組中10個SnRK2成員可以對不同的逆境信號作出反應，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7都可以受NaCl的誘導表達。體外表達試驗發現，所有的10個成員都可以被滲透脅迫激活，但是僅有部分成員被ABA激活。表明不同的激酶成員有其獨特的滲透脅迫信號反應方式。Boudsocq等[8]在對擬南芥基因組的10個SnRK2成員的研究中發現，其中9個SnRK2成員可以被甘露醇和NaCl所誘導激活，在這9個成員中又僅有5個可以同時被ABA激活；所有的SnRK2成員都不被冷處理激活。

筆者所在課題組通過同源克隆的方法，從玉米(ZeamaysL.)中克隆了1個全長的cDNA，編碼的蛋白與SnRK2b蛋白有很高的同源性。由于這個基因可以受不同的逆境條件誘導，所以把它命名為：ZmSPK1 (for stress-induced protein kinase)(accession number AY722708)。在酵母細胞中表達ZmSPK蛋白，激酶活性分析試驗發現，純化的ZmSPK1蛋白不但具有自我磷酸化功能，而且還可以催化底物磷酸化，說明ZmSPK1編碼一個有功能的蛋白激酶。半定量RT-PCR分析表明，ZmSPK1的表達可以被甘露醇、高鹽和脫落酸(abscisec acid,ABA)誘導；另外，在不同的組織中，ZmSPK1的表達水平也有很大的差異，在生殖器官中的表達量最高[9,10]。這些結果表明，ZmSPK1可能不但參與了植物對逆境的反應過程，而且在植物的發育過程中起著重要的作用。為了研究ZmSPK1的生物學功能，本課題組構建了植物表達載體，在擬南芥中過量表達ZmSPK1基因，希望從對轉基因植株的分析中初步了解其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為擬南芥(Columbia 生態型) ；菌株E.coliDH5α、農桿菌GV3101均由農業部作物營養與施肥重點實驗室保存。

DNA 凝膠回收試劑盒購自杭州V-gene 生物技術公司;DNA 限制性內切酶、T4-DNA 連接酶、ExTaq 酶、DNAMarker DL2000+15000購自寶生物大連有限公司(Takara 產品)； anti-HA(3f10) 購自Roche Applied Science(Germany)； peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG(H+L) 購自中杉金橋公司；PVDF 膜購自Milipore 公司；其他試劑都是國產分析純。PCR 引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成； DNA 測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 試驗方法

(1)ZmSPK1基因植物表達載體的構建 在pBluescriptKS(+)中間載體上含有pBluescriptKS(+)-ZmSPK1-dHA-His6片段。用BamHⅠ/StuⅠ雙酶切上述載體質粒，回收ZmSPK1的cDNA片斷，同時筆者所在實驗室的帶有外源基因的中間載體pUC18-cDNA-dHA也用相同的酶切，去除插入的外源基因，回收載體片斷，最后把兩個片斷連接，構建成pUC18-ZmSPK1-dHA的中間載體。酶切驗證與預期結果一致后，用XbaⅠ/EcoRⅠ酶切，得到在35S啟動子、C4PPDK增強子控制下的片斷：35S -C4PPDK-ZmSPK1-dHA,同時，筆者所在實驗室保存的含有相同插入結構(僅插入的外源基因不同)的植物表達載體pGreen0029,也用相同的雙酶切，回收載體片斷，與上述的插入片斷連接，得到在35S啟動子和增強子控制的，在pGreen0029載體里表達的ZmSPK1-dHA融合蛋白。連接體系4 ℃反應24 h 后轉化E.coliDH5α,轉化后挑取陽性克隆提質粒酶切驗證,酶切驗證正確的菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。以上所用所有載體均由本實驗室保存。

(2)ZmSPK1 基因的擬南芥轉化 正確連接的質粒用凍融法轉化農桿菌GV3101,轉化后的農桿菌用花浸蘸法[10]轉化擬南芥。

(3)轉基因擬南芥的PCR 分子檢測 轉化擬南芥T0 代的種子經消毒后播在含卡那霉素( 濃度為50 μg/mL) 的MS培養基上進行篩選,挑選在抗性培養基上正常生長的擬南芥植株提取基因組DNA,以DNA為模板,以ZmSPK片斷內部的一對特異引物做PCR 鑒定。

(4)轉基因擬南芥的Western-blot 檢測 取0.3 g經PCR 鑒定呈陽性的擬南芥幼嫩的葉片,加0.5 mL 蛋白提取緩沖液( 配方為：10 mmol/L Tris-HCl,0.02% NaN3,0.001% PMSF,pH8.0) ,液氮研磨后5 000 r/min、4 ℃離心10 min,吸取上清液,即為總蛋白提取液。取適當總蛋白提取液電泳,轉膜后以小鼠單克隆抗體ant-HA 為一抗,peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) 為二抗進行Western-blot 檢測。

2 結果與分析

2.1 ZmSPK1基因植物表達載體的構建

圖1 構建好的ZmSPK1植物表達載體示意圖Figure 1 Restriction map of ZmSPK1 in plant expression vector pGreen0029

將含有ZmSPK1的片段插入pGreen0029載體相應位置，構建成如圖1所示的植物表達載體。連接體系轉化大腸桿菌后,挑陽性克隆提質粒,進行酶切驗證。結果如圖2 所示,所得的酶切片段與期望值完全一致,初步證明已經連接成功。隨后，酶切驗證正確的質粒進行測序,做進一步驗證,測序結果確認了重組質粒的正確性( 測序圖未顯示)。

2.2 轉基因擬南芥的分子鑒定

經過測序確認的載體挑取酶切驗證正確的質粒，轉化農桿菌GV3101,在抗性培養基上挑取篩選后的GV3101單菌落，提質粒首先進行PCR驗證，選取兩管擴增出陽性條帶的質粒再一次轉化大腸桿菌，提質粒，酶切驗證正確的GV3101可以用來進行下一步的擬南芥轉化。轉化后收取T0代擬南芥種子,播在含有50 μg/L卡那霉素的MS培養基上。種子發芽后大多數幼苗子葉變黃,最后死亡,只有少部分幼苗仍然發綠,并且正常的長出真葉,保持正常的生長狀態,這部分很有可能就是轉化了的幼苗(圖3)。

M:DNAmarker;1:重組質粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA經Xba/PstⅠ雙酶切結果;2:重組質粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA經SacⅠ單酶切結果圖2 重組質粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA的酶切驗證Figure2 RestrictionanalysisofrecombinantplasmidspGreen0029-ZmSPK1-dHAfragment圖3 擬南芥基因轉化T0代種子篩選Figure3 SelectionoftransgenicseedsfromT0generation

在抗性培養基上正常生長的T1代幼苗被轉移到土壤中，待植株充分長大，有足夠葉子時，取2～3片幼葉，提取總DNA，并以ZmSPK1基因的特異引物進行PCR擴增。結果如圖4所示，野生型植株沒有擴增出相應條帶，同時也發現，抗性篩選的幼苗也有假陽性，例如第6和第9泳道相對應的株系就沒有陽性條帶。

經PCR初步鑒定的株系，進一步提取總蛋白，用anti-dHA單克隆抗體，通過Western-blot進一步在蛋白水平檢測基因的表達。結果如圖5所示，多數PCR陽性株系在相應的位置有特異性的印跡條帶，當然有的株系和野生型植株一樣沒有印跡條帶，這個結果表明，有些轉基因株確實表達了目的基因，同時也有一些發生了基因沉默現象。

M:Marker;1:WT;2:質粒陽性對照;3～11:不同的抗性株系圖4 T1代轉基因幼苗PCR鑒定Figure4 PCRanalysisofT1transgenicseedlings1:WT;2～6:不同的轉基因株系圖5 PCR鑒定呈陽性的植株的Western-blot鑒定Figure5 Western-blotanalysisofthedifferentlinesafterPCRanalysis

3 結論與討論

有研究結果顯示，SnRK2b組的許多成員參與了高鹽或者高滲透脅迫反應。例如PK-3和SPK-4都可以被脫水和高鹽所誘導表達[11]；水稻基因組中10個SnRK2成員都可以對不同的逆境信號作出反應，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7可以受NaCl的誘導表達[7]，通過在NCBI中比對，可以發現ZmSPK1與SAPK6氨基酸序列的一致性最高，達到了90%；擬南芥基因組中10個SnRK2成員中的9個成員可以被甘露醇和NaCl所誘導激活[8]，ZmSPK1與其中的SnRK2.4氨基酸序列一致性達到78%，并且ZmSPK1序列也是通過SnRK2.4基因序列作為探針獲得的；另外，本研究中RT-PCR實驗也表明ZmSPK1的表達受高鹽和滲透脅迫的誘導。因此推斷本課題組克隆的ZmSPK1參與了植物的抗鹽信號途徑。為了驗證并探明其在抗鹽途徑中的作用，本研究構建了ZmSPK1的植物表達載體，成功轉入模式植物擬南芥中，并且獲得了穩定表達的株系，后期的功能驗證工作正在進行中。

[1]Gancedo J M.Yeast carbon catabolite repression[J].Microbio Mo Bio Rev,1998,62：334～361.

[2]Ronne H.Glucose repression in fungi [J].Trends Genet,1995,11：12～17.

[3]Sato R,Goldstein J L,Brown M S.Replacement of Serine-871 of hamster 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase prevents phosphorylation by AMP-activated protein kinase and blocks inhibition of sterol synthesis induced by ATP depletion [J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90：9261～9265.

[4]Corton J M,Gillespie J G,Hardie D G.Role of the AMP-activated protein kinase in the cellular stress response [J].Curr Biol,1994,4：315～324.

[5]Kudo N,Barr A J,Barr R L,etal.High rates of fatty acid oxidation during reperfusion of ischemic hearts are associated with a decrease in malonyl-CoA levels due to an increase in 5’-AMP-activated protein kinase inhibition of acetyl-CoA carboxylase [J].J Biol Chem,1995,270：17513～17520.

[6]Halford N G,Hardie D G.SNF1-related protein kinases：global regulators of carbon metabolism in plants [J].Plant Mol Biol,1998,37：735～48.

[7]Kobayashi Y,Yamamoto S,Minami H,etal.Differential activation of rice sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J].Plant Cell,2004,16：1163～1177.

[8]Marie B,Hé lène B B,Christiane L.Identification of Nine Sucrose Nonfermenting 1-related Protein Kinases 2 Activated by Hyperosmotic and Saline Stresses inArabidopsisthaliana[J].J Bio Chem,2004,279:41758～41766.

[9]Zou H W,Ma G H,Li C H,etal.Expression,purification and kinase activity analysis of maizeZmSPK1,a member of plant SnRK2 subfamily [J]. Afr J Bio,2009,8：2959～2962.

[10]Zou H W,Zhang X H,Zhao J R,etal.Cloning and characterization of maizeZmSPK1,a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J].Afr J Biotech,2006,5:490～496.

[11]Yoon H W,Kim M C,Shin P G,etal.Differential expression of two functional serine/threonine protein kinases from soybean that have an unusual acidic domain at the carboxy terminus [J].Mol Gen Genet,1997,255：359～371.

2010-03-03

國家自然科學基金項目(30700433)；中國農科院農業資源與農業區劃研究所，農業部作物營養與施肥重點實驗室開放基金(KFJJ2010-03)

鄒華文(1973-)，男，江蘇邳州人，理學博士，副教授，研究方向為植物逆境分子生物學.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.016

S513;Q789

A

1673-1409(2010)02-S049-04