香根草種子外植體組織培養與快速繁殖

姚 振，朱桂才，任文雙，陳 漢

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

香根草種子外植體組織培養與快速繁殖

姚 振，朱桂才，任文雙，陳 漢

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

為建立香根草(Vetiveriazizanioides)種子的組織培養和快速繁殖體系，以香根草種子為外材料，進行了種子萌發、叢生芽誘導、愈傷組織誘導與分化及生根研究。結果表明，種子在采收初期發芽率達到90%以上，4 ℃低溫貯藏能有限延長種子的壽命；無菌苗叢生芽誘導系數高達7.3；在MS培養基上，0.5 mg/L的2,4-D對種子愈傷組織誘導效果最佳；愈傷組織在MS + 6-BA 2.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L上分化率達到55.1%，繁殖系數為15.4；在添加0.2 mg/L IAA的MS培養基上，生根培養效果較好。

香根草(Vetiveriazizanioides)；種子；組織培養；快速繁殖

香根草(Vetiveriazizanioides)又名巖蘭草，是自然界具有最長根系的多年生禾本科高大草本植物，具有生物量大、分蘗迅速、適應性強、生態幅度寬、易栽種易管理等特點[1]。由于香根草在提取香根油、制造紙張、編織手工藝品、驅蟲治病、保持水土、凈化污水、土壤改良、受損生態環境的修復以及用作飼料、燃料等方面的作用，受到各國政府、科學家和生產者的高度重視。香根草被全球100多個國家和地區引種栽種，用于水土流失治理與污染環境的改良，絕大多數都取得了良好效果，從而被稱為“神奇牧草”[1～4]。

雖然香根草生態工程受到廣泛重視和應用，然而種苗缺乏嚴重制約著進一步推廣，而導致種苗缺乏的主要原因是繁殖速度過慢[5]。生產上通常靠分株或分蘗進行繁殖，為了提高香根草的繁殖系數，國外已經通過花序組織[6～8]、葉[8～10]及幼苗的其它部分[11]建立了再生體系，國內也有相關報道[12，13]。

香根草分為開花和不開花2種，在印度北部發現的野生種大部分是有性繁殖，而印度南部2種習性都有發現[14]。2002年在廣東吳川野外采集到的香根草種子，成功繁殖出香根草幼苗，表明廣東吳川香根草屬于有性繁殖型，也反映了天然香根草之所以成群落分布的原因[15]。劉金祥等[16]利用種子繁殖香根草，并進行了有性繁殖植株的生物學觀察。近期的研究表明，香根草在湖北的引種和種子繁殖是成功的[17]。

本研究在了解香根草種子發芽率、貯藏條件的基礎上，利用種子建立無菌體系，以無菌苗為材料進行叢生芽誘導，以種子為外植體進行組織培養，進一步研究激素配比對叢生芽、愈傷組織誘導與分化以及生根誘導的影響，建立以種子為材料的組織培養和快速繁殖體系，對于利用有性繁殖的變異，選育矮化、抗旱、耐寒和綠期較長的新品種具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用香根草種植于長江大學園藝園林學院實踐教學基地，為2007年和2008年采收的種子。

1.2 方法

(1)貯藏溫度對種子壽命的影響 將2007年10至11月采收的種子，設置2種貯藏條件，即室溫保存和4 ℃低溫保存。貯藏的時間為10、12、14、17、18個月，貯藏后每次隨機抽取種子50粒，25 ℃恒溫培養2周后，記錄發芽的種子數目，計算發芽率。

(2)叢生芽的誘導 將種子用自來水沖洗數次，75%的酒精消毒30 s，然后轉入0.1%的升汞中浸泡8 min，最后用無菌水沖洗數次，晾干后轉入MS培養基中25 ℃恒溫培養。

當無菌苗長出2～3片葉時，轉入從生芽誘導培養基中進行叢生芽誘導。設計4個處理，2種誘導培養基以MS添加4.0 mg/L 6-BA為基本培養基，分別添加IAA和IBA，使用濃度為0.2 mg/L。每種叢生芽誘導培養基中的幼苗分別作剪葉和不剪葉處理。剪葉處理是將無菌苗上部的葉片剪掉一部分，然后將植株輕輕插入叢生芽誘導培養基中，剪葉處理的植株在幾天后會重新長出新葉，繼續剪葉處理，持續直到有叢生芽的產生為止；不剪葉處理作對照。

每個處理3瓶，每瓶接種5顆，3次重復。從叢生芽出現開始，每隔5～7 d記錄一次叢生芽數量，3個月后記錄總數，計算叢生芽誘導系數。叢生芽誘導系數=每瓶叢生芽總數/5。

(3)以香根草種子誘導愈傷組織 將種子置于愈傷組織誘導培養基上，誘導培養基設置2,4-D濃度4個水平(0、0.5、1.0、2.0 mg/L)，每處理種子50粒。分別在2周和4周以后記錄愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率(%)=(產生愈傷組織的種子數量/種子總數)×100。

(4)繼代分化培養 將種子愈傷組織轉瓶于繼代分化培養基上，繼代分化培養基以MS培養基添加1.0 mg/L的NAA為基本培養基，設2種6-BA濃度(1.0、2.0 mg/L)，記錄愈傷組織分化率、繁殖系數。愈傷組織分化率(%)=(分化的愈傷組織數目/愈傷組織總數)×100，繁殖系數=愈傷組織分化的芽總數/分化愈傷組織總數。

(5)生根誘導與移栽 分化的愈傷組織切成帶單個芽的小片和直接用無菌苗誘導的香根草叢生芽，剪掉葉片至1～2 cm長度，2種材料轉瓶于3種生根誘導培養基上。3種生根培養基分別為：MS + NAA 0.2 mg/L和MS + NAA 0.2 mg/L + IAA 0.2 mg/L，以MS培養基為對照。

直接用無菌苗誘導的叢生芽分為單株插入誘導生根培養基中，采用MS培養基為基本培養基，蔗糖30 g/L及瓊脂8 g/L，pH5.8。每個處理13棵植株，每瓶1棵。分化的愈傷組織帶單個芽切片插入誘導生根培養基中，每處理15棵，每瓶1棵。實驗過程中記錄生根數、芽數，計算生根率。生根苗煉苗后，常規方法移栽。

2 結果與分析

2.1 種子萌發率測定及貯藏條件

圖1 貯藏時間和貯藏溫度對香根草種子發芽率的影響Figure 1 Effects of storage time and temperature on seed germination rate of vetiver

室溫下保存的種子前3次發芽率分別為97%、84%、68%，最后2次沒有種子萌發。冷藏條件下的發芽率前3次與室溫下接近，分別為94%、89%、65%，后2次分別為45%、8%。從發芽率的結果看，初期90%以上的發芽率是遠高于有關報道的。采收初期種子的發芽率很高，甚至全部萌發，但隨時間的推移發芽率慢慢下降(圖1)。室溫下貯藏種子的時間不能超過14個月，否則發芽率大幅下降。低溫貯藏對于延長種子壽命是有利的，但延長的時間也是有限的，低溫下貯藏不能超過17個月。

2.2 無菌苗的叢生芽誘導

種子接種于MS培養基上，7 d后種子開始發芽，13 d后種子發芽率為96.7%。無菌苗轉入叢生芽誘導培養基后，約1個月產生大量叢生芽，3個月叢生芽誘導系數達到最高值。4個處理的叢生芽誘導系數差異不顯著(F=3.816，P=0.092)。從表1可以看出，2種激素組合都能夠誘導出叢生芽，培養基中添加6-BA + IAA的誘導效率要高于添加6-BA + IBA的處理，但差異不顯著(F=3.659，P=0.104)；剪葉處理的叢生芽誘導系數顯著高于不剪葉處理(F=8.414，P=0.027)。

表1 植株處理方式和培養基對香根草叢生芽誘導的影響Table 1 Effects of plant treatment and media on clustered shoots induction of vetiver

注：S-N-K法顯著性檢驗，同列中不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

表2 2,4-D濃度對香根草種子愈傷組織誘導的影響Table 2 Effects of different concentration of 2,4-D on seed callus induction of vetiver

2.3 愈傷組織誘導

接種5 d，對照組種子開始露芽。在2,4-D誘導的情況下，種子前期出現大量帶芽的愈傷組織，隨著誘導時間的延長，芽逐漸消失。從最終誘導率看，0.5 mg/L 2,4-D濃度處理愈傷誘導率最高，達到了100%，較低濃度的2,4-D有利于誘導愈傷組織的形成(表2)。較高濃度2,4-D在早期可以抑制芽的生長，但最終愈傷誘導率降低。

2.4 繼代分化培養

(1)6-BA對愈傷組織分化的影響 繼代4 d后2.0 mg/L濃度下的愈傷組織開始分化，6 d后1.0 mg/L濃度下的愈傷組織開始分化。1.0 mg/L濃度下平均分化率為27.4%，2.0 mg/L濃度下平均分化率為55.1%，從研究結果看，2.0 mg/L的6-BA有利于愈傷組織的分化，1.0 mg/L的6-BA有利于愈傷組織的繼代培養。

(2)繁殖系數 從表3可以看出，2.0 mg/L的6-BA能夠增加分化的繁殖系數。1.0 mg/L 6-BA及1.0 mg/L NAA激素誘導下，33個愈傷組織分化了9個，分化芽數121個，繁殖系數為13.6，2.0 mg/L BA及1.0 mg/L NAA激素誘導下，37個愈傷組織分化了20個，分化芽數309個，繁殖系數為15.4。不同的愈傷組織分化的芽數在4到30之間。

表3 不同6-BA濃度下愈傷組織分化的繁殖系數Table 3 Propagation coefficient of callus differentiation on different concentration of 6-BA

2.5 生根誘導

(1)采用無菌苗誘導的香根草叢生芽的生根誘導 無菌苗誘導的叢生芽分為單株插入誘導生根培養基中，4周后，植株生根并產生分蘗。結果表明，從2個處理的無菌苗生根過程中產生的分蘗總數上看，添加NAA和IAA處理分蘗數的平均值為7.8，而單獨使用NAA的處理為3.9，表明同時添加NAA和IAA有利分蘗的誘導。

幾乎所有的植株都可以在生根誘導培養基上生根，生根根數的平均數差異不大，同時添加NAA+IAA處理的為4.1，添加IAA處理的為3.6，根數從1到9，差異很大，個別不生根。試管苗在無激素的MS培養基上也能生根，但根系細弱、生長緩慢。

表4 NAA與IAA對帶芽愈傷組織切片生根的影響Table 4 Effects of NAA and IAA on rooting of callus slices

(2)帶芽愈傷組織切片的生根誘導 20 d后，分化苗開始生根，并發出很多小芽(表4)，帶單個芽的愈傷組織切片在2種培養基下產生的芽數相近，但培養基MS+0.2 mg/L IAA的生根率略高于培養基MS + 0.2 mg/L IAA + 0.2 mg/L NAA的。

3 小結與討論

3.1 香根草種子的萌發與壽命

香根草種子在剝離穎和稃前，有些是空粃，含有種子的顆粒本身帶有的病菌使得種子生活力下降，萌發時污染，這些可能是萌發低率的原因。前期的研究表明香根草種子的萌發率低于9.5%[17]，而本研究的發芽率在90%以上，可能是前期的研究中種子帶真菌和空秕的原因。香根草是一種典型的熱帶植物，但適應性強，可在10～45 ℃的地區下生長[18]，但本研究區域，由于冬季的低溫，結實穗比較少。熱帶植物的種子壽命一般比較短，低溫貯藏可以延長種子的壽命。由于研究區域處于長江流域，香根草的有效結實穗比較少，采收種子有限，研究受到種子數量的限制，沒能準確得知種子發芽率下降的準確時間，只是確定了種子發芽率下降大致的時間段。總的說來，香根草種子的壽命在2 a以內，限制了種子的長期保存和利用。種子壽命詳細資料的獲得需要進一步的研究。

3.2 剪葉處理可以促進叢生芽誘導

禾本科植物的快速繁殖一般用在遺傳轉化、優良植株的繁育等方面。利用無菌苗誘導叢生芽的方法比傳統的分蘗、插條、切頂等方法簡便，并且不經過愈傷組織階段直接誘導叢生芽可避免產生大量的變異，耗材少、不受季節限制、增殖效果顯著。本研究采用細胞分裂素和生長素結合，成功誘導了香根草的叢生芽，剪葉處理比不剪葉處理的叢生芽誘導率要高，可能是剪葉削弱了植株的頂端優勢，促進了腋芽的發育。生長素IBA和IAA也在叢生芽的誘導中起了作用，使用IAA的效果要好于IBA。香根草無菌苗植株比較高大，在MS培養基下產生叢生芽比較慢，這種剪葉處理在快速繁殖過程中，一方面可以節約空間，另一方面增加了繁殖的系數，具有重要的應用意義。該項技術可能可以應用在禾本科植物，如水稻、小麥的組織培養和遺傳轉化中。

3.3 2,4-D在成熟胚愈傷組織誘導中的作用

在誘導成熟胚愈傷組織過程中，2,4-D是用得最為廣泛的生長素類激素。水稻誘導愈傷組織，2,4-D是誘導愈傷組織的重要因素，在一定濃度范圍內，2,4-D濃度越高，出愈率越高[19，20]。本研究采用2,4-D也成功誘導了香根草種子的愈傷組織。

3.4 生根誘導

來源于種子直接誘導的叢生芽的生根誘導與愈傷組織分化幼苗的生根誘導存在很大的區別，主要表現在生根過程中分蘗數的差異。愈傷組織分化幼苗的生根誘導中分蘗產生芽數多數在10以上，可能是研究中肉眼可見的帶單個芽的愈傷組織切片帶有很多芽體。在根的誘導中，NAA和IAA均對生根有促進作用，在生產應用中可以適當添加這些激素促進生根。

[1]劉金祥，陳 燕．我國大陸唯一的大面積成群落分布的優良水土保持植物——香根草的用途與保護問題[J]．草業科學，2002，19(7)：13～16．

[2]程 洪．香根草在我國的應用及研究綜述[J]．水土保持通報，1998，18(3)：77～81．

[3]Xu L Y.The international vetiver workshop[J].Vetiver Newsletter,1997,18:65～68.

[4]Ruth E L.Compact callus induction and plant regeneration of a non-flowering vetiver from Java[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2000,62:115～123.

[5]夏漢平，劉世忠．香根草優良生態型篩選研究[J]．草業學報，2003，12(2)：97～105．

[6]Keshavachandran R,Khader M A.Growth and regeneration of vetiver (Vetiveriazizanioides(L.) Nash) callus tissue under varied nutritional status[A].Edison S,Ramana K V,Sasikumar B,etal.Biotechnology of Species,Medicinal and Aromatic Plants.Proceedings of National Seminaron Biotechnology of Spices and Aromatic Plants[C].Indi,Calicut,1997.60～64.

[7]Nanakorn M,Surawattananon S,Wongwattana C,etal.Invitroinduction of salt tolerance in vetiver grass(VetiveriazizanioidesNash)[J].J Weed Sci Tech,1998,43:134～137.

[8]Sreenath H L,Jagadishchandra K S,Bajaj Y P S.XXVIIVetiveriazizanioidesNash (Vetiver Grass):Invitroculture,regeneration,and the production of essential oils[A].Bajaj YPS.Biotechnology in Agriculture and Forestry[C].Berlin,Heidelberg,Springer-Verlag,1994.403～421.

[9]Mathur A K,Ahuja P S,Pandey B,etal.Potential of somaclonal variations in the genetic improvement of aromatic grasses[A].Kukreja A K,Mathur A K,Ahuja P S,etal.Tissue Culture and Biotechnology of Medicinal and Aromatic Plants[C].India,Luc-know,Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants,1989.79～89.

[10]Mucciarelli M,Gallino M,Scannerini S,etal.Callus induction and plant regeneration inVetiveriazizanioides[J].Plant Cell Tiss Org Cult,1993,35:267～271.

[11]George M M,Subramanian R B.High frequency regeneration ofVetiveriazizanioidesvia mesocotyl culture[J].Phytomorphology,1999,49:309～313.

[12]殷麗青，柴曉玲，沈國輝，等．香根草組織培養快速繁殖技術[J]．上海農業學報，2005，21(4)：63～66．

[13]韓 露，劉必融，潘 超，等．香根草愈傷組織的誘導和快速繁殖[J]．安徽師范大學學報，2004，27(4)：443～445．

[14]Anonymous.Vetiveria[Z].Council of Scientific and Industrial Research,Delhi,1976,Vol.10.

[15]吳齊強，蘇海平．環保“寶貝”研究取得重大突破，湛江種子繁殖香根草成功[N]．人民日報，2003-06-11(1)．

[16]劉金祥，李文送，李紅燕．種子繁殖香根草植株的生物學特征及其病蟲害初報[J]．草業科學，2005，22(4)：108～111．

[17]姚 振，朱桂才，劉 華．香根草種子繁殖特性研究[J]．長江大學學報(自然科學版)農學卷，2007，4(4)：13～15．

[18]National Research Council.Vetiver grass:a thin green line against erosion[M].Washington,D C:National Academy Press,1993.

[19]姚方印，朱常香，劉理梅，等．提高水稻成熟種胚愈傷組織誘導率及再生率的研究[J]．山東農業科學，2000，(4)：7～9．

[20]張 平，左示敏，李愛宏．提高農桿菌轉化水稻頻率幾個因素的研究[J]．中國水稻科學，2004，18(1)：11～15．

2009-11-19

姚 振(1980-)，男，湖北荊州人，農學碩士，講師，研究方向為植物分子生物學與植物學.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.017

Q813.1;Q949.71+4.2

A

1673-1409(2010)02-S053-05