胞內聚-β-羥基丁酸酯對蘇云金芽胞桿菌營養細胞耐受性的影響

胞內聚-β-羥基丁酸酯對蘇云金芽胞桿菌營養細胞耐受性的影響

以蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)BMB171及其聚-β-羥基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)合成基因簇(phaRBC)強化菌株BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻斷突變株BMB171-p為研究對象，系統比較BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株之間對逆環境耐受能力(包括耐熱、抗凍、抗紫外和耐饑餓)的差別。結果表明：胞內PHB能增強蘇云金芽胞桿菌菌體對逆環境的耐受能力。

聚-β-羥基丁酸酯；蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)；逆境生理；耐受性

聚-β-羥基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)是微生物細胞在其生長的特定時期在胞內合成具有相應功能的聚羥基烷酸酯，它可作為菌體內的一種儲備性碳源[1]。此外，還發現細菌胞內 PHB在菌株對逆環境的耐受性中扮演著重要角色。Lopez等[2]對巨大芽胞桿菌(Bacillusmegatroium)和其PHB合成缺陷型突變株在土壤中生存能力進行對比實驗，發現積累PHB對巨大芽胞桿菌在自然環境中生存是一種優勢。戴美學等[1]發現苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)PHB合成缺陷型表現出生長競爭能力的嚴重缺陷和競爭結瘤能力的大幅度下降。另外通過調節培養條件比較Pseudomonassp.在產PHB和不產PHB 2種情況下菌株耐熱以及抗氧化的能力，結果表明能夠產生PHB的菌株對逆環境具有更強的抗性[3]。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種昆蟲致病菌，對鱗翅目、鞘翅目等農林業害蟲及蚊蟲等衛生害蟲具有殺蟲活性，是應用最為廣泛的微生物殺蟲資源。Bt在生長階段，能夠積累聚-β-羥基丁酸(PHB)，可作為合成芽胞和殺蟲晶體蛋白的能源儲藏物質[3]。為探討蘇云金芽孢桿菌胞內的PHB是否也扮演細胞抗逆角色，本研究以無質粒突變株BMB171及其PHB合成基因簇(phaRBC)強化菌株 BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻斷突變株 BMB171-p為對象，考察對數期末期營養體細胞對逆環境條件處理(包括熱處理、冷處理、紫外輻照以及饑餓處理)的存活能力。

國內外對于蘇云金芽胞桿菌中PHB的生理功能還未有具體報道。通過研究蘇云金芽胞桿菌中PHB對菌體生理的影響，揭示了PHB在蘇云金芽胞桿菌中所扮演的生物學功能，為進一步深入研究蘇云金芽胞桿菌中PHB的代謝奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

蘇云金芽胞桿菌無質粒突變株BMB171(B.thuringiensissubsp.kurstakiBMB171 )；蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171+p， 來源于BMB171， 通過轉入帶有PHB合成基因簇(phaRBC)的質粒載體pHT304， 構建成PHB高產突變株；蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171-p，來源于BMB171，通過與帶有PHB合成基因部分同源片段的質粒pEG491 進行同源重組， 阻斷PHB合成酶基因phaC， 得到PHB合成缺失突變株。所有菌株均由筆者所在實驗室構建并保存。

1.2 培養基

(1)斜面培養基 LB固體培養基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5，120 ℃，15 min滅菌。

(2)種子培養基 LB 液體培養基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸餾水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5,15 min滅菌。

(3)發酵培養基 PM培養基：蛋白胨10 g， 葡萄糖5 g， 酵母抽提物2 g，KH2PO41.0 g， MgSO4·7H2O 0.3 g， FeSO4·7H2O 0.02 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，初始pH 7.2～7.5，115 ℃，20 min滅菌待用。

1.3 方法

(1)菌液制備 將斜面菌種轉接到種子培養基中，培養7 h(30 ℃， 200 r/min )，然后取0.2 mL接入20 mL 發酵培養基中， 培養10 h(30 ℃，200 r/min)后，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用磷酸緩沖液(pH 6.8 )洗滌2次后加無菌水恢復至原來體積，放置備用。

(2)耐熱試驗 吸取0.5 mL 菌液加入到已預熱好的裝有4.5 mL無菌水的試管中，分別用45 ℃、50 ℃ 、55 ℃和60 ℃ 4種溫度水浴恒溫加熱，稀釋平板計數，測定殺死90%的菌體所需要的時間。

(3)低溫耐受試驗 將菌體在發酵培養基中培養至穩定期初期，分裝至1.5 mL 離心管中，放置-20 ℃低溫冰柜中，5 d后稀釋平板計數，計算存活率。

(4)抗紫外試驗 將菌液稀釋100倍，取30 mL放入平板中，于距離40 W紫外燈55 cm處分別照射40、60、80、160 s，稀釋平板計數，計算存活率。

(5)耐饑餓試驗 將菌液分裝至1.5 mL 離心管中，室溫(25 ℃ )放置，每天稀釋平板計數，計算存活率。

1.4 指標測定

生物量測定采用稀釋平板記數法[5]；同步率測定采用顯微計數法[5]；胞內PHB的檢測采用蘇丹黑染色和顯微照相[6]；胞內PHB濃度測定采用紫外分光光度計測定法[6]。

2 結果與分析

2.1 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株在對數生長末期PHB的合成

蘇云金芽胞桿菌在斜面保存中以芽孢形式存在，將芽孢接入種子培養基中復蘇，復蘇后接入發酵培養基中生長，對每一種蘇云金芽胞桿菌都可以保證群體同步生長。通過蘇丹黑染色可以發現，處于對數生長期的BMB171(BMB171+p同 )菌株菌體中能看到明顯的墨黑色顆粒，而同時期的BMB171-p菌體中不存在(圖1)，說明BMB171(BMB171+p同 )能正常表達產生PHB顆粒存在于體內，而PHB合成基因缺失的突變株BMB171-p不能生成PHB。通過制作3種蘇云金芽胞桿菌的生長曲線可以看出，菌體中PHB合成與菌體生長偶聯，PHB含量在對數生長期末期達到最大(圖2)。進一步測定菌株在對數生長末期PHB的含量，詳見表1。

a.BMB171(BMB171+p圖略，同BMB171;b.BMB171-p圖1 蘇丹黑染色后處在對數生長期的3種菌菌體形態(1 000×)Figure 1 The morphology of the three kinds of logarithmic growth phase cells by sudan black staining(1 000×)

2.2 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株耐受試驗

(1)耐熱性試驗 分別測定受4種溫度(45、50、55、60 ℃)處理的對數生長末期營養體細胞的死亡率，計算BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株受熱死亡90%時所需要的時間(即菌體受熱死亡特征值D90)，并對熱處理溫度作圖，詳見圖3。

通過比較BMB171+p、BMB171和BMB171-p3菌株受熱死亡特征值D90值，發現三菌株的耐熱能力強弱順序為：BMB171+pgt;BMB171gt;BMB171-p。處理溫度為45 ℃ 和50 ℃時，BMB171+p、BMB171菌體的D90值(分別為32.5 min、11.5 min和25 min、9.5 min)遠大于 BMB171-p菌體的D90值(12 min、6 min)，3種菌的D90值區別顯著(Plt;0.01)；較高溫度(55、60 ℃)時，3種菌的D90值區別不如較低溫度時明顯。

(2)抗凍性試驗 由表2可見，將3種菌的菌體在-20 ℃下放置5 d后，BMB171+p的菌體還有108CFU/mL存活，存活率為15.91%；BMB 171菌體也有108CFU/mL存活，存活率為 14.93%；而BMB171-p菌體的活菌數降為107CFU/mL，存活率僅為0.93%。

a.BMB171;b.BMB171+p;c.BMB171-p圖2 蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株的生長曲線和PHB含量Figure 2 The contents of PHB in growth of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain

圖3 3類菌株營養細胞在不同溫度下的D90值Figure 3 The D90 of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated at different temperatures

菌株胞內PHB含量/(mg/mL)BMB171+p1.248BMB1710.844BMB171-p0.000

表2 3種菌株營養細胞冷凍耐受存活率Table 2 The survival ratio of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated by frozening

圖4 BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株菌體在紫外下照射不同時間的存活率Figure 4 The survival ratio of three kind of vegetative cells treated by ultraviolet rays at different times

圖5 BMB171及其PHB基因強化和阻斷菌株菌體耐饑餓存活率Figure 5 The survival rates on starvation of vegetative cells of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain at the end of the logarithmic growth phase treated with different day

(3)抗紫外試驗 3種菌株對紫外的耐受性試驗結果見圖4。由圖4可看出，照射40 s時，BMB171+p和BMB171菌體存活率分別為82.18%和72.67%，而BMB171-p 菌株菌體存活率只有4.12%。照射80 s后，BMB171+p 和BMB171菌體存活率基本相同，照射160 s后，活菌數為107CFU/mL ，BMB171-p 菌體存活率在照射60 s時就降為0.91% ，照射160 s后活菌數降為105CFU/mL。

(4)耐饑餓試驗 由圖5可知，耐饑餓試驗處理1 d后BMB171的存活率為22.4%，BMB171+p的存活率為25%，BMB171-p的存活率為0.82%；2 d后分別為20.9%、23.9%和0.20%，其中，BMB171+p和BMB171菌株的活菌數仍為108CFU/mL，而BMB171-p菌株的活菌數降為107CFU/mL，且BMB171-p菌體出現自溶現象。

3 結論與討論

本研究探討了蘇云金芽胞桿菌BMB171及其PHB合成基因增強(phaRBC+)工程菌BMB171+p和PHB合成基因阻斷(phaC-)突變株BMB171-p合成PHB能力及其菌體對環境耐受性的差別。結果表明，BMB171+p和BMB171菌株均能在對數生長期合成PHB，最大量分別為1.248 mg/mL和0.844 mg/mL，而BMB171-p菌株不能合成PHB。通過取對數末期菌體進行環境耐受試驗發現，在熱、寒冷、紫外和饑餓環境中，BMB171+p和BMB171菌體的存活率均遠遠大于BMB171-p菌體，說明BMB171+p和BMB171菌體對環境的耐受性明顯強于BMB171-p菌體，其中BMB171+p菌體耐受能力又略強于BMB171菌體。

由于PHB是以顆粒狀和可溶性2種狀態存在于菌體中，顆粒狀PHB能在胞內大量儲存而不影響胞內外的滲透壓，是一種理想的儲存材料[7]，可溶性的PHB多為低相對分子質量PHB，它被發現是細胞質[8]、質膜[9]以及線粒體和微粒體膜[10]的組成成分，并能與其它生物大分子連接在一起，在許多生物體內廣泛分布[11]。本研究結果表明phaC基因的阻斷導致細胞對熱、冷和紫外的抗逆能力急劇下降，推測可能與低相對分子質量的PHB合成受阻，從而喪失PHB對細胞膜和細胞質有關活性成分的保護，且PHB具有不飽和雙鍵對紫外有一定的吸收作用；PHB在菌體饑餓時可能參與了碳代謝，增強了菌體的耐饑餓能力。同時，增加胞內phaRBC基因簇拷貝數盡管大幅提高胞內PHB的合成量，但僅微弱提高菌體抗逆能力，可能是保護細胞所需的特定性狀PHB量已基本滿足需要。因此可以推斷：蘇云金芽胞桿菌中胞內PHB能增強菌體對環境的耐受性，提高菌體存活能力；并且這種能力和PHB濃度胞內的濃度有一定關系。

雖然胞內PHB存在可提高菌體抗逆能力的現象在越來越多的菌株中得到證明，但是否具有普遍性，以及PHB深層次的抗逆機制等問題還有待闡明，同時是否通過PHB合成基因的轉入，構建對逆環境耐受性高的工程生物也是值得探索的課題。

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2010-04-14

嚴 瑾(1982-)，女，湖北孝感人，工學碩士，助教，研究方向為微生物工程.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.018

Q935

A

1673-1409(2010)02-S058-05