中度嗜熱混合菌在攪拌槽中浸出黃銅礦及其群落動態

周洪波，謝英劍，張汝兵，曾偉民，羅海浪，王玉光

(中南大學 資源加工與生物工程學院，生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙，410083)

生物冶金技術由于其具有反應條件溫和、對環境友好、能耗少、成本低等優點，已廣泛應用于難處理金礦的生物氧化預處理和次生硫化銅礦的浸出[1]。黃銅礦作為最具有商業價值的硫化銅礦物之一，在世界上所知銅礦儲量中含量最大。隨著銅的需求量持續增加，研究黃銅礦的生物浸出具有重大意義。目前，采用常溫生物浸出黃銅礦的反應速度緩慢，難以獲得較高的銅浸出速率和浸出率[1?2]。而中度嗜熱菌與常溫菌相比具有一定的優勢。這是因為隨著浸出的進行，硫化礦物氧化以及微生物代謝產生大量的熱量，可以使整個浸出體系的溫度升高到50 ℃，局部溫度甚至可以達到75 ℃或者更高[3]，此時常溫菌通常已經死亡或失去活性，而中度嗜熱菌在該溫度下可以保持較高的活性，可以快速浸出硫化礦，因此，在工業浸出黃銅礦中，與常溫菌相比，中度嗜熱菌具有一定的優勢。槽浸是生物浸出工業應用中常用的工藝之一，其浸出體系中傳質效果好(如攪拌、通氣等)，可以較方便地對體系的主要工藝參數進行控制，適合硫化礦物精礦的浸出[4]。浸礦工藝中有關微生物生態學的研究對于發展生物浸出技術具有重要的指導意義，只有了解浸礦體系中的生態結構和主要微生物種群動態變化規律，才能通過浸礦工藝的調控，優化浸礦微生物群落結構，從而提高浸出速率[5]。Brierley認為, 理解生物浸出中的微生物學過程尤其是微生物生態規律是提高工藝水平的關鍵[6]。PCR-RFLP(限制性酶切片段長度多態性)方法是一種非常成熟的基于 PCR的基因指紋圖譜技術，目前已廣泛應用于酸性礦坑水(AMD)中的微生物類群分析[7]，而對于生物浸出工藝中(如柱浸，槽浸等反應體系中)浸礦微生物的種群動態變化研究較少[8?9]。為此，本文作者采用 PCR-RFLP技術研究黃銅礦攪拌浸出過程中微生物群落變化動態，并分析pH值、電位等參數的變化對微生物群落動態變化的影響，以便為調控微生物種群結構、優化浸出工藝過程、提高浸出速率和浸出率提供指導。

1 材料和方法

1.1 礦樣和菌種

實驗所用黃銅礦精礦來自江西德興。礦石經粉碎后過篩，粒徑≤75 μm。

經X線衍射(XRD)分析，礦物主要由80%左右(質量分數，下同)黃銅礦、5%左右黃鐵礦、5%左右石英等成分組成。礦樣的元素分析結果為：32.02% Cu，22.65% S，30.90% Fe。礦物元素組成見表1。

表1 礦樣成分的能譜分析結果Table 1 Mineral sample composition by energy spectrum analysis

本實驗所用菌種主要為Acidithiobacillus caldus，Leptospirillum ferriphilum，Sulfobacillus acidophilus和Sulfobacillus thermosulfidooxidans等中度嗜熱菌種的混合菌，純菌菌株均由教育部生物冶金重點實驗室分離和保藏。其中：At. caldus為硫氧化細菌；L. ferriphilum為亞鐵氧化細菌；S. acidophilus和S. thermosulfidooxidans既能氧化硫又能氧化亞鐵。菌種的培養用9K基本鹽溶液加入10 g/L的黃銅礦精礦。培養條件如下：pH=1.8，溫度為45 ℃，轉速為170 r/min。9K基本鹽的成分為：(NH4)2SO43.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Ca(NO3)20.01 g/L。

1.2 實驗裝置及條件

浸礦實驗是在1個總容積為2.6 L的有機玻璃反應器中進行，內徑為140 mm，高為170 mm，有1根通氣管沿槽壁豎直通向槽底，并且水平彎折。在水平通氣管的下面開一排小孔，氣體從小孔中分散通入。用2個恒流泵加入H2SO4或者NaOH來調節初始pH值。pH值和電極電位Eh的測量值可以從微型電腦上直接讀取。實驗裝置如圖1所示。

圖1 實驗裝置Fig.1 Experiment device

把反應器裝入圓形玻璃恒溫水浴缸中，使反應器內浸出液恒定維持在45 ℃，實際裝液量為2 L(9K基本鹽培養基)，礦漿質量濃度為10 g/L。菌種富集物以1.1×106個/mL的接種濃度被接入反應器，浸出時間為30 d。反應條件為：初始pH=2.0，溫度為45 ℃，攪拌漿轉速為500 r/min，通氣量為0.6 L/min。

1.3 儀器和試劑

實驗儀器有：玻璃圓形水浴鍋；通氣泵；測量pH值和Eh的復合電極(Pt, Ag/AgCl)(JENCO，美國任氏公司生產)；原子吸收儀(北京華洋分析儀器有限公司生產)；恒流泵(HL-2S，上海滬西分析儀器有限公司生產)。

實驗試劑為：重鉻酸鉀溶液，Taq DNA 聚合酶(MBI，USA)；pGEM-T 載體(Promega，USA)；內切酶MspⅠ和Hin 6 Ⅰ ( M BI)。測序由北京三博遠志生物公司完成。

1.4 分析方法

每2 d取樣分析，用原子吸收方法測定浸出液中總Fe2+和Cu2+的濃度，用重鉻酸鉀滴定法測定Fe2+的濃度，在總鐵含量中去除Fe2+含量即為Fe3+含量。應用血球計數板測定菌數；每天記錄浸出液的 pH值和Eh值。浸出結束后得到的礦渣經洗滌及冷凍干燥后，與未浸出的礦樣一起應用化學滴定分析的方法測定銅的含量，計算銅的浸出率。

1.5 RFLP分析

1.5.1 DNA的提取

每隔 6～8 d取浸出液 100 mL(含固體)提取總DNA，提取方法參照文獻[10]。方法如下：在10 000 r/min轉速下離心固液混合樣品，去除上清液，剩余物冷凍干燥后與2 g干熱滅菌的沙子混合，加液氮研磨3次，用13.5 mL的DNA抽提緩沖液(0.1 mol/L 磷酸鈉，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB (pH=8.0))溶解研磨產物，加入50 μL蛋白酶K (10 g/L)，經37 ℃水浴30 min，加入1.5 mL 20%的SDS，于65 ℃水浴2 h(每隔15 min輕微搖動1次)，于4 000 r/min轉速下離心15 min，轉移上清液至新的離心管中，然后，加入等體積異丙醇，混勻并放入4 ℃冰箱中過夜, 最后以10 000 r/min離心15 min，棄上清液并加入2 mL預冷的70%乙醇洗滌2次，于室溫干燥后用100 μL TE溶解。粗提DNA，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA，USA)進行回收純化。

1.5.2 PCR擴增和純化

提取得到的總DNA，用16S rRNA基因通用引物63F，1387R(63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R：5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)來進行擴增[12]，對所得的PCR產物進行純化。所得片段長度為1.4 kb左右。

1.5.3 克隆

其次，你們需要接受自己，獲得自信能量。初中階段的你們不僅小秘密多了，情感也更加細膩敏感。越優秀的學生對自我的認同感就越高，一旦理想和現實出現差距，失落感就會更強烈。這時候，如果能客觀認識現狀，接受成長中的自己，讓自己的優點更加“明亮”，缺點更加“暗淡”，我一定會離你們遠遠的。

把純化后的片段連接到pGEM-T載體中，在16 ℃水浴中過夜，轉化到Ecoli DH5α[0]感受態細胞內。涂平板用藍白篩選的方法挑選出陽性克隆子。利用通用載體引物 M13F(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)和 M13R(5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’)對菌落PCR擴增出插入片斷。然后，用內切酶MspⅠ和Hin 6Ⅰ對插入片斷進行酶切，在37 ℃酶切24 h。最后，用 3%的瓊脂糖凝膠作酶切分析，得到圖譜。對顯現不同條帶的克隆子(OTU)進行測序，在GENBANK中進行序列比對，鑒定細菌種類。

2 結果和分析

2.1 浸出實驗

浸出液中微生物含量的變化見圖2。可見：經過對數生長期后在第 7天左右細菌濃度達到最大，為2.6×107個/mL；然后略有下降。但是，基本維持在2×107個/mL以上。經推測，部分菌體已經吸附到礦物顆粒上。

圖2 浸出液中微生物含量的變化Fig.2 Variation of cell number in leachate

浸出液中pH和Eh變化曲線見圖3。可見：接種后電位為400 mV，在第1天內電位很快升高，然后緩慢上升，在第15天到第19天這一階段又有一個比較明顯的上升階段，然后，電位穩定在660 mV左右。與電位相對應，pH值在第1天內下降比較明顯，然后，一直呈平緩下降的趨勢。在浸出過程的后期，pH值基本保持不變。

使用重鉻酸鉀滴定法測定溶液中Fe2+的質量濃度時發現(見圖4)：浸出液中Fe2+質量濃度非常低，應用原子吸收所測定的總鐵濃度近似等于 Fe3+質量濃度；在第16天左右，總鐵的質量濃度最高，達到0.72 g/L，然后開始下降，到反應結束時下降到0.49 g/L。銅的浸出持續增加，浸出液中 Cu2+的質量濃度最高達到0.63 g/L。應用化學滴定分析法，計算得出最后Cu的浸出率為 26.2%。該浸出率不高，可能與銅精礦殘留的浮選藥劑有關，即浸礦微生物活性受到了一定程度的抑制。

圖3 浸出液中pH和Eh變化曲線Fig.3 Variations of pH and Eh in leachate

圖4 浸出液中Cu2+和Fe2+的質量濃度變化曲線Fig.4 Concentrations of Fe2+ and Cu2+ in leachate

2.2 微生物群落分析

在第8，16，24和第30天分別取樣，因為差異條帶只有3種，所以，每個樣挑取80個左右白色菌落，可足夠保證結果的可靠性。陽性克隆的比例為96%。酶切圖譜的條帶類型見圖5。從酶切圖譜來看，各階段OTU數量的差異性比較明顯。挑選差異性的3個陽性克隆子測序，在GENBANK數據庫比對后，發現2種是At. caldus，分別編號為AC-1和AC-2；1種為L. ferriphilum，編號為LF ；沒有檢測到代表其他菌種的OTU。在NCBI上比對后發現AC-1和AC-2序列與登錄號為DQ661629.1的At. caldus相似度達到99%，LF的序列與登錄號為EF025338.1的L. ferriphilum相似度達到99%。

圖5 酶切圖譜的條帶類型Fig.5 RFLP pattern of 16S rRNA gene digested by restriction enzymes

在第8天時，群落中占優勢地位的是At. caldus。總共挑取 82個克隆子，AC-1樣占全部克隆子數的62%，AC-2占全部克隆子數的34%，At. caldus總共占96%；代表L. ferriphilum的LF僅占全部克隆子數的4%。

到第16天時，84個陽性克隆子中AC-1占總數的31%，AC-2占總數的21%，At. caldus總共占52%；LF占總數的48%。At. caldus和L. ferriphilum兩者的數量已經基本相當。

到第24天時，87個陽性克隆子中AC-1占總數的33%，AC-2占總數的17%，At. caldus總共占50%；LF占總數的50%。At. caldus和L. ferriphilum的數量仍然基本相當。

3 討論

黃銅礦的氧化過程開始于質子對礦物的攻擊和Fe3+的氧化攻擊[11?12]。由黃銅礦的晶格結構可知，它的化合價鍵在S，Cu和Fe之間相互形成，結構穩定，鍵能很高。在電子傳遞過程中，Fe3+和H+攻擊黃銅礦的晶格結構，接受S與金屬之間化合鍵斷裂后的電子，使Cu2+和Fe2+釋放到溶液中。其中，浸礦細菌所起的作用是將Fe2+氧化為Fe3+，將S氧化為硫酸。生成的Fe3+可以繼續對礦物起氧化作用。具體反應[13]如下：

浸出過程發生的反應很復雜，除上述反應外，浸出液中還會發生如下反應：

在每個浸出實驗中，都能觀察到 pH值的持續下降和Eh的持續升高[14]。這是因為浸出過程是一個不斷產酸和有Fe3+釋出的過程。氧化還原電位Eh由液相中的主要離子對濃度比 c(Fe3+)/c(Fe2+)和 c(H+)/c(OH?)來決定。當溶液中Fe2+濃度非常低時，Eh取決于Fe3+濃度及 pH值的變化[15]。從反應式(2)～(6)可以看出：浸出過程中不斷產生H+，使pH值持續下降。由反應式(1)可知：當細菌濃度增大并起氧化作用后，浸出液中Fe3+濃度也將越來越高，所以，電位也隨之升高(如圖3)。

影響黃鉀鐵礬形成的主要因素包括pH值、溫度及硫酸鐵介質的濃度[16]。當溫度恒定時，主要受H+和硫酸鐵介質濃度的影響。如反應式(3)～(6)所示，鐵沉淀的生成使溶液中如 K+，SO42?，NH4+等許多離子的濃度都發生了變化。從圖4可知：在第16天以后，浸出液中Fe2+質量濃度開始下降，可推測是黃鉀鐵礬大量生成的緣故。從圖3可以看出，當生成黃鉀鐵礬時Eh有上升的趨勢。這是因為 H+增加，此階段 pH值下降。

由RFLP分析可知：該中等嗜熱槽浸系統中微生物多樣性并不豐富，只有L. ferriphilum 和At. caldus被檢測到，生物多樣性遠低于酸性礦坑水或堆浸系統中的多樣性。這主要是因為槽浸系統的溫度恒定，而且pH值、氧氣、CO2、營養物水平都較均一。Foucher等[17]通過對傳統機械攪拌反應器和氣升式懸浮顆粒柱狀反應器中微生物群落組成情況進行研究發現：L. ferrooxidans，At. caldus以及 S. thermosulfidooxidans是這2種反應器中主要的微生物種群。可見：這些反應器內的種群多樣性同樣并不豐富。

在浸出開始時，At. caldus是優勢菌，豐度為96%，在浸出進行過程中，L. ferriphilum逐漸占主導地位，豐度為69%。這可能是礦物溶解后釋出的硫元素轉變為多硫化合物覆蓋在礦物表面，在浸礦體系中最后氧化得到由元素硫形成的一層硫膜，而 At. caldus可以氧化元素硫變成硫酸[11]。只有在硫膜被逐漸溶解，礦物中慢慢釋放出Fe2+的情況下，L. ferriphilum才能迅速生長并起作用。此外，還存在鐵濃度、pH值、Eh等因素的影響。Okibe等[18]的實驗研究結果表明，在低 pH值和高離子選擇壓力下，Leptospirillum spp.和Ferroplasma spp.將成為浸出過程中的優勢種群，相反，在pH值較高時，Acidithiobacillus 和 Sulfobacillus是群落中的主要成員。Demergasso等[19]的研究表明：Leptospirillum spp.的生長與pH值密切相關。實驗所用的At. caldus最適pH值為2.3左右，L. ferriphilum的最適pH值為1.6左右；L. ferriphilum比At. caldus能夠耐受更高的離子選擇壓力。因此，在第8天的樣品中，L. ferriphilum的含量只占微生物總量的4%；在浸出結束的第30天的樣品中，L. ferriphilum的含量達到了微生物總量的69%，這可能與pH值下降有關。

4 結論

(1) 中等嗜熱混合菌浸出黃銅礦過程中溶液 pH值逐漸下降，Eh持續升高，這是因為浸出體系的復雜反應不斷產酸并有Fe3+釋出。浸出中間階段Fe3+質量濃度下降，是由于有黃鉀鐵礬沉淀生成。

(2) 槽式攪拌反應器中浸出黃銅礦精礦的微生物群落結構簡單，微生物種類不豐富，應用 PCR-RFLP方法只檢測到 2種微生物，分別為 At. caldus和L. ferriphilum。這是因為反應器浸出體系的選擇壓力更大。

(3) 槽式攪拌反應器中浸出黃銅礦精礦的群落動態變化很明顯。在浸出開始階段，At. caldus 是優勢種群，其豐度為96%。隨著浸出的進行，L. ferriphilum 逐漸增多，在浸出后期代替At. caldus成為優勢種群，其豐度為69%。

[1]Rawlings D E, Dew D, du Plessis C. Biomineralization of metal-containing ores and concentrates[J]. Trends Biotechnol,2003, 21(1): 38?44.

[2]Gericke M, Pinches A, Rooyen J V. Bioleaching of a chalcopyrite concentrate using an extremely thermophilicculture[J]. Int J Miner Process, 2001, 62: 243?255.

[3]Olson G J, Brierley J A, Brierley C L. Bioleaching review part B:Progress in bioleaching: applications of microbial processes by the minerals industries[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 63(3): 249?257.

[4]Brierley C L. Bacterial succession in bioheap leaching[J].Hydrometallurgy, 2001, 59(2): 249?255.

[5]Acevedo F. The use of reactors in biomining processes[J].Electronic Journal of Biotechnology, 2000, 3(3): 184?194.

[6]周洪波, 邱冠周, 鄔長斌, 等. 嗜酸微生物生態學與礦物生物浸出技術[J]. 應用與環境生物學報, 2005, 11(6): 784?788.ZHOU Hong-bo, QIU Guan-zhou, WU Chang-bin, et al.Ecology of acidophilic microorganisms and mineral bioleaching technologies[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2005, 11(6):784?788.

[7]劉新星, 霍強, 劉學端, 等. 古礦井區域酸性礦坑水微生物群落的多樣性[J]. 中南大學學報: 自然科學版, 2007, 38(3):414?420.LIU Xin-xing, HUO Qiang, LIU Xue-duan, et al. Diversity of microbial community in acid mine drainage in ancient mine area[J]. Journal Central South University: Science and Technology, 2007, 38(3): 414?420.

[8]Johnson D B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms[J]. FEMS Microbiol Ecol, 1998, 27(4):307?317.

[9]Schrenk M O, Edwards K J, Goodman R M, et al. Distribution of Thiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans:Implications for generation of acid mine drainage[J]. Science,1998, 279: 1519?1522.

[10]Zhou J Z, Bruns M A, Tiedje J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(7): 316?322.

[11]Sand W, Gehrke T, Jozsa P G, et al. (Bio)chemistry of bacterial leaching––direct vs. indirect bioleaching[J]. Hydrometallurgy,2001, 59(2): 159?175.

[12]Tributsch H. Direct versus indirect bioleaching[J].Hydrometallurgy, 2001, 59(2/3): 177?185.

[13]舒榮波, 阮仁滿, 溫建康. 黃銅礦生物浸出中鈍化現象研究進展[J]. 稀有金屬, 2006, 30(3): 395?399.SHU Rong-bo, RUAN Ren-man, WEN Jian-kang. Review on passivation of chalcopyrite during bioleaching process[J].Chinese Jouranal of Rare Metals, 2006, 30(3): 395?399.

[14]Meruane G, Vargas T. Bacterial oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5?7.0[J].Hydrometallurgy, 2003, 71(1/2): 149?158.

[15]楊紅斌, 荊秀艷. Fe3+離子在低品位銅礦生物浸出中的行為分析[J]. 西安科技大學學報, 2005, 25(2): 183?186.YANG Hong-bin, JING Xiu-yan. Fe3+behavior in the low copper bioleaching[J]. Journal of Xi’an University of Science and Technology, 2005, 25(2): 183?186.

[16]王長秋, 馬生鳳, 魯安懷, 等. 黃鉀鐵礬的形成條件研究及其環境意義[J]. 巖石礦物學志, 2005, 24(6): 109?113.WANG Chang-qiu, MA Sheng-feng, LU An-huai, et al. The formation conditions of jarosite and its environmental significance[J]. Acta Petrologica et Mineralogical, 2005, 24(6):109?113.

[17]Foucher S, Brunet F B, Hugues P, et al. Evolution of the bacterial population during the batch bioleaching of a cobaltiferous pyrite in a suspended-solids bubble column and comparison with a mechanically agitated reactor[J].Hydrometallurgy, 2003, 71(1/2): 5?12.

[18]Okibe N, Gericke M, Hallberg K B, et al. Enumeration and characterization of acidophilic microorganisms isolated from a pilot plant stirred-tank bioleaching operation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(4): 1936?1943.

[19]Demergasso C S, Galleguillos P P A, Escudero G L V, et al.Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper ore bioleaching test heap[J]. Hydrometallurgy,2005, 80(4): 241?253.