啤酒糟預處理技術

鄧啟華,傅 力,王德良,劉 霞,林智平,賈鳳超

(1新疆農業大學食品科學學院,新疆烏魯木齊,830052)

2(北京燕京啤酒股份有限公司,北京,101300)

3(中國食品發酵工業研究院,北京,100027)

啤酒糟是啤酒企業最大宗的副產物之一,資源非常豐富,其主要成分是蛋白質、纖維組分和其他營養物質,因此,啤酒糟的綜合利用一直受到國內外研究工作者的重視[1-4]。但是啤酒糟中的纖維含量較高,中性洗滌纖維 (NDF)含量高達 50%(水分低于 10%的干糟)以上,包括纖維素、半纖維素和木質素,它們之間相互形成緊密的結構,導致難以被降解利用,作為一種飼料原料在單胃動物 (如豬)上的使用范圍非常有限[5],大大降低了啤酒糟的潛在價值。因此在進一步開發利用前有必要對啤酒糟進行預處理,降低啤酒糟的纖維含量。

纖維質原料的預處理技術目前研究較多,包括物理法 (如粉碎、輻射、爆破,擠壓膨化等)、化學法 (酸法、堿法、氧化法和有機溶劑等)、生物法 (微生物腐朽法和酶解法)和聯合法 (物化聯合、物生聯合)等[6-11]。這些預處理技術在啤酒糟研究開發中很少應用,本研究主要采用超微粉碎、蒸汽爆破和纖維素酶解法預處理技術,探討預處理前后啤酒糟纖維組分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干啤酒糟:取自北京燕京啤酒股份有限公司;纖維素酶,夏盛酶制劑公司;3,5-二硝基水楊酸,國藥集團化學試劑有限公司。

HZS-H水浴振蕩器,哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;HG53鹵素水分測定儀,METTLER TOLEDO公司;UN IC 2100分光光度計;QUANTA 200型環境電子掃描顯微鏡,FEI公司;QBS-80型蒸汽爆破設備,鶴壁市正道重機廠;FDV超微粉碎機,佑崎有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 啤酒糟主要營養成分的檢測

由農業科學院飼料研究所檢測中心檢測。

1.2.2 啤酒糟的預處理

對照啤酒糟:不經任何處理,干燥至恒重,備用。

蒸汽爆破啤酒糟:爆破前對爆破汽缸蒸汽預熱至100℃左右,往汽缸填 200 g干啤酒糟進行爆破,爆破時間均為 60 s,爆破壓力從 1-3 MPa共處理了 7個條件 ,由強到弱分別標記為 1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#。爆破后的啤酒糟經干燥至恒重,備用。

超微粉碎啤酒糟:50 g干啤酒糟直接放入 FDV超微粉碎機粉碎 3 min,干燥至恒重,備用。

1.2.3 啤酒糟中還原糖檢測

采用 3,5-二硝基水楊酸比色法,簡稱 DNS法,具體步驟參見QB 2583-2003,繪制標準曲線。

1.2.4 啤酒糟中纖維組分的檢測:

NDF、ADF和 ADL測定根據 GB/T20806-2006和 GB/T20805-2006方法測定。其中,在每一次抽濾后的干燥過程,使用 HG53鹵素水分測定儀代替方法中的烘箱干燥,其他不變,其中 NDF-ADF=半纖維素;ADF-ADL-灰分 =纖維素,ADL=酸洗木質素。檢測原理及其流程簡圖如圖1所示。

圖1 啤酒糟纖維組分檢測流程簡圖

1.2.5 啤酒糟中還原糖的浸提

5 g啤酒糟用 100 mL的緩沖液制成 5%濃度的溶液,在 50℃水浴振蕩器中浸提 30 min,轉速為 100 r/min,最后在 5 000 r/min下離心 10 min,上清液按照DNS方法檢測還原糖,結果用 mg/mL表示,下同,若浸提液中還原糖濃度較高,進行適當稀釋后進行檢測。

1.2.6 啤酒糟的電子掃描顯微鏡 (SEM)觀察

樣品直接粘臺,通過離子點濺射樣品表面噴鍍一層薄薄的導電金屬電子層 (即噴金),放入掃描電鏡樣品室進行樣品表面形貌觀察。

1.2.7 酶解啤酒糟正交試驗

根據單因子試驗結果對啤酒糟酶解條件進行優化,選擇加酶量、反應時間、底物濃度、反應溫度作為實驗因子,每個因子選擇 3個水平,以酶解液中的還原糖含量作為評價指標,采用 L9(34)正交試驗設計,設計方案見表 1。

表1 酶解啤酒糟正交試驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 啤酒糟的主要營養成分

表2 啤酒糟的營養成分 %

圖2 不同預處理條件下的電鏡掃描圖(25,1 000分別為 25×和 1 000×視角下的電鏡掃描圖)

2.2 預處理前后啤酒糟纖維結構的變化

通過觀察圖2的啤酒糟電鏡掃描圖可以發現,未處理啤酒糟中呈規則片段結構較多,同時結構非常致密,超微粉碎中規則形狀纖維物質較少,但是纖維的結構很致密,說明超微粉碎技術對啤酒糟的纖維形態結構影響很小。經過蒸汽爆破后的啤酒糟規則形狀片段也較少,且纖維片段變得蓬松,1 000×視角下可以明顯看到纖維原來的致密結構已經松弛,呈現了多孔隙結構,這種結構有利于酶的作用,纖維素酶可以直接接觸到啤酒糟纖維內部的作用點。

2.3 預處理前后啤酒糟還原糖和 NDF含量的變化

啤酒糟中纖維結構的破壞,可能增加啤酒糟中還原糖的含量。利用 1.2.5所描述的浸提條件,浸提液用 DNS法檢測還原糖,結果如圖3所示。

圖3 預處理前后還原糖的變化

由圖3可知,未處理啤酒糟浸提液的還原糖含量很低,超微粉碎預處理后的啤酒糟浸提液的還原糖變化不大,說明超微粉碎預處理后啤酒糟的纖維結構沒有得到根本破壞。蒸汽爆破預處理后的啤酒糟樣品,隨著處理強度的提高,還原糖含量有逐漸升高的趨勢。值得注意的是,2#糟的處理強度低于 1#糟,但是還原糖含量卻更高,蒸汽爆破處理強度不能太高。

圖4 預處理前后啤酒糟 NDF的變化

NDF指標包含了幾乎所有的纖維素、半纖維素、木質素等所有纖維組分,因此這個指標可代表啤酒糟中總纖維含量。從圖4可以發現,未處理的啤酒糟NDF值最高,達 62.9%,超微粉碎后的啤酒糟樣品NDF變化很小,也說明超微粉碎預處理技術在降低啤酒糟纖維含量作用非常有限;蒸汽爆破后的啤酒糟樣品的NDF值變化最明顯,隨著爆破處理強度的提高,NDF含量逐步降低。1#降低到了 35.5%,降低率達 43.6%。從纖維素、半纖維素、木質素這些指標可以發現,預處理前后的啤酒糟半纖維素含量變化最為顯著;纖維素變化不大,蒸汽爆破后的啤酒糟 ADL含量有所增加,這可能是由于蒸汽爆破處理后物料的損失以及一些半纖維素又與木質素之間形成假木質素造成。

2.3 纖維素酶水解啤酒糟的條件摸索

2.3.1 不同加酶量對啤酒糟酶解的影響

加酶量對酶促反應具有很大影響,加酶量不足,則底物不會被充分水解;充足的加酶量使底物得到充分降解,然而過量加酶量必然導致生產成本增加。此次試驗酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度從 1-240 U/g,pH自然,50℃恒溫水浴反應時間 6 h,轉速 100 r/min,結果如圖5所示。

表3 預處理前后啤酒糟纖維組分的變化 %

圖5 不同加酶量對啤酒糟酶解的影響

從圖5可以發現,隨著酶濃度的提高,酶解液中還原糖含量有明顯增長。但是酶濃度從 120 U/g到240 U/g時,還原糖增長趨勢不再明顯,因此選擇酶濃度為 60 U/g、120 U/g、180 U/g作為正交優化的條件。

2.3.2 反應時間對啤酒糟酶解的影響

基于酶反應時間對水解效果有顯著的影響,同時基于酶的穩定性是一個限制因素,經過一定酶促反應時間后,酶的活性可能降低;同時考慮到將來可能的生產應用性,過長時間處理后會徒增生產周期,所以應該維持合理的酶解時間,因此酶水解時間是一個重要研究因素。在底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH自然、轉速 100 r/min的條件下,本研究在 50℃恒溫水浴條件下,分別反應 1-7 h,研究反應時間對啤酒糟酶解的影響,結果如圖6所示。

圖6 反應時間對酶解效果的影響

從圖6可以看出,還原糖量隨著時間的增加而不斷增加,在開始一段時間內,還原糖量增加趨勢明顯,而隨著時間的延長,增加趨勢變得平穩,這符合一般酶水解反應規律,可能主要是由酶部分失活和產物抑制所導致。因此啤酒糟的酶解反應時間控制在 5-7h比較合適。

2.3.3 底物濃度對啤酒糟酶解的影響

底物濃度對酶促反應具有很大的影響,當底物濃度遠遠小于 Km值時,酶反應速度與底物濃度成線性關系,提高底物濃度可以提高反應速度;而在低底物濃度時,底物中含有的可被有效水解的纖維組分較少,因此最終得到的水解液中的還原糖含量較少,因此從生產的角度來考慮,底物濃度高對生產成本的降低有好處。當反應進行一段時間后,底物總量減少,產物的量增加,對酶促反應會產生抑制,不利于反應向正方向進行。本研究的酶解條件:底物濃度 2.5%-20%,酶濃度 120 U/g,pH自然,50℃恒溫水浴反應 5 h,轉速 100 r/min,結果如圖7所示。

在研究底物濃度對酶解效果的影響試驗中,發現不同的底物濃度,酶解過濾后的上清液體積變化很大,這對還原糖的檢測結果影響很大,因此在此實驗中,把上清液統一稀釋到 100 mL,稀釋后的還原糖濃度檢測值作為檢測結果來表示。由圖7可知,隨著底物濃度的增加,還原糖含量也逐步增加,在底物濃度為 10%達到最大值。隨后底物濃度再提升,其還原糖濃度有所下降。因此,選擇底物濃度控制在 5%-10%之間比較合適。

圖7 底物濃度對酶解效果的影響

2.3.4 pH值對啤酒糟酶解的影響

pH對酶促反應也有很大的影響,每一種酶都有一個最適 pH。本實驗用的纖維素酶的說明書上的最適 PH為 4.8。此次試驗的酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH 3.6-7.7,50℃恒溫水浴反應 5 h,轉速 100 r/min,結果如圖8所示。

圖8 不同 pH值對啤酒糟酶解的影響

通過上圖可知,通過緩沖液調節 pH時,pH在5.2左右時酶解液中還原糖含量最高。值得注意的是,pH 5.2時的還原糖含量低于 pH在自然條件 (即不用緩沖液調 pH值,直接用純凈水配制,此時 pH約6.7左右)下的值,當把緩沖液 pH調到 6.8時,其酶解液中的還原糖只有 1.1 mg/mL,遠遠低于 pH自然的情況。這說明,pH緩沖液中含有限制纖維素酶的因子。因此,酶解啤酒糟的 pH值就采用自然條件。

2.3.5 溫度對啤酒糟酶解的影響

溫度對酶促反應有很大的影響,在一定范圍內,升高溫度可以加快酶-底物中間體分解轉化為產物的速度;然而溫度過高會降低酶反應速率,因為酶是蛋白質,溫度過高會降低酶的穩定性,使其失活,從而影響酶水解的最終作用效果。此次試驗的酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH自然,40-60℃恒溫水浴反應 5 h,轉速 100 r/min,結果如圖9所示。

圖9 溫度對啤酒糟酶解的影響

從圖9可見,50℃時酶解效果最好,60℃時還原糖含量下降很快,酶解啤酒糟的最適溫度在 50℃左右,而纖維素酶在 60℃下失活較快。因此,酶解啤酒糟是溫度應當控制在 45-55℃合適。

2.3.6 酶解啤酒糟正交試驗

根據表 2的實驗設計方案進行試驗,正交試驗結果見表 4。

表4 酶解啤酒糟正交試驗結果表

從表 4可以很直觀的看出,影響啤酒糟酶解的影響因素的主次關系分別為:A＞C＞D＞B,最佳酶解條件組合是:A3C2D2B3.這和前面單因素試驗摸索的條件基本一致,也和正交試驗中的最大值的酶解條件基本一致,說明這幾個因素之間不存在明顯的交互作用。在進行方差分析之前,因為作用時間的影響最低,因此把它作為方差分析中的空閑因子,即誤差列。方差分析結果見表 5,可以得到,酶濃度和底物濃度是酶解啤酒糟的顯著影響因子。通過正交試驗,得到最佳的酶解啤酒糟的條件為:酶濃度 180 U/g,底物濃度為 10%,溫度為 50℃,作用時間為 6 h,pH自然。

表5 酶解啤酒糟正交試驗方差分析表

2.5.7 最佳酶解條件下的啤酒糟的酶解效果

根據最佳酶解條件,對未處理啤酒糟、超微粉碎啤酒糟、蒸汽爆破的 1#、2#、7#啤酒糟進行酶解,結果如表 6所示。

從表 6可以明顯看出,在最佳酶解條件下,各種糟的酶解效果均得到了明顯提高。1#啤酒糟的還原糖凈增值達 12.77 mg/mL,蒸汽爆破后的啤酒糟的NDF值與酶解前對比,特別是 1#、2#,基本沒有變化,但是其 NDF值也比未處理啤酒糟經酶解后的 NDF值低。說明,蒸汽爆破預處理技術結合纖維素酶水解技術,可以明顯降低啤酒糟中的纖維含量,同時還原糖含量也得到大幅提高。

表6 最佳酶解條件下啤酒糟的酶解效果

3 結論

蒸汽爆破預處理技術能有效的破壞啤酒糟纖維致密的形態結構,使其變得松弛,呈現多孔隙結構,而超微粉碎預處理技術對啤酒糟的結構作用效果很小;超微粉碎預處理后的啤酒糟其還原糖含量變化較小,NDF降低率僅 10.5%;蒸汽爆破預處理后的啤酒糟還原糖含量明顯增加,NDF降低率高達 43.6%,作用效果非常明顯;經預處理的啤酒糟其主要變化的纖維組分是半纖維素,纖維素和木質素含量變化不明顯;纖維素酶解啤酒糟的最佳條件是:酶濃度 180 U/g,底物濃度為 10%,溫度為 50℃,作用時間為 6 h,pH自然;蒸汽爆破技術結合纖維素酶解技術可以有效的降低啤酒糟中的纖維含量,同時提高了還原糖含量。

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