均勻設計法優(yōu)選銀杏葉總黃酮及其降糖作用的研究

胡旭濤

均勻設計法優(yōu)選銀杏葉總黃酮及其降糖作用的研究

胡旭濤

目的 研究超聲輔助提取銀杏葉總黃酮的最優(yōu)工藝及降糖作用。方法 采用均勻設計優(yōu)化提取工藝，STZ建立糖尿病大鼠模型，并進行降糖研究。結(jié)果 最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲波強度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%，黃酮提取率為(2.59±0.06)%，且降糖作用顯著。結(jié)論 超聲輔助提取能夠?qū)崿F(xiàn)銀杏葉總黃酮的常溫快速提取,且降糖作用顯著。

銀杏；總黃酮；超聲輔助；均勻設計

現(xiàn)代藥理研究證實銀杏黃酮可抑制血糖的升高，可預防和治療糖尿病[1]，具有改善高脂喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗和降低血脂的作用，銀杏葉黃酮可能成為治療2型糖尿病和高脂血癥的新藥。本實驗研究了超聲輔助在銀杏葉總黃酮提取中應用的可行性及其藥理作用，為進一步研究銀杏葉總黃酮及其藥理作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 材料：廣惠和大藥房；化學試劑為分析純。儀器：JA2003型電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京紅葉科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲輔助銀杏葉總黃酮提取工藝 稱取干燥過40目的銀杏葉5g，石油醚浸泡24h,過濾，3000r／min離心10min，沉淀物各預設條件(超聲波強度、固液比、乙醇濃度)在水浴中進行超聲輔助提取，提取3次，過濾，以3500r／min離心10min，得上清液，濃縮，再加入20倍體積的乙醇，超聲溶解，2℃冰箱中放置，過夜，3500r／min離心10min,氯仿萃取三次，濃縮冷凍干燥，備用。

1.2.2 含量測定 參照原愛紅[2]的測定方法采用蘆丁為對照品，蘆丁含量(y)與質(zhì)量濃度(X，mg／L)最小二乘法得回歸方程為Y=2.51X+2.17864，相關系數(shù)R=0.9997。

1.2.3 均勻設計實驗法 以影響有效成分提取率的固液比，乙醇濃度，超聲波強度為因素，各因素取3個水平，探求超聲輔助提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝。用均勻設計3.0版軟件篩選出u9(33)表安排實驗[3]，數(shù)據(jù)見表1。

1.2.4 動物模型的建立及其處理 正常對照組：SD大鼠喂以普通飲食，其中碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，其他8%。糖尿病組和處理組：喂以高脂飲食，其中碳水化合物40%，蛋白質(zhì)13%，脂肪40%，其他7%，3個月后，一次性腹腔注射STZ25mg(kg.bw)，其他組均腹腔注射檸檬酸緩沖液，并繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。72h后尾靜脈取血，分別測血糖及胰島素，凡血糖濃度＞13mmol/L，尿糖呈強陽性者，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿者為糖尿病模型，然后對照組和糖尿病組喂飼普通飼料，自由飲水外，每天以蒸餾水灌胃(2.5ml／d)。處理組每只大鼠給予銀杏葉黃酮60mg／kg分別灌胃，每天灌胃1次，共10周，末次給藥后禁食12h，乙醚麻醉，靜動脈取血，分離血清，測定血糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設計實驗結(jié)果 本實驗通過均勻設計3.0版軟件中自選變量法進行數(shù)據(jù)分析，采用固液比A、乙醇濃度B、超聲波強度C對應變量總黃酮提取率Y多元逐步回歸法進行分析，回歸分析采用后退法,顯著性水平α＝0.05，得回歸方程Y=0.635X1+0.314X2+0.342X3，復相關系數(shù)：R=0.9998,檢驗值Ft=12.27,臨界值F(0.05,3,3)＝8.277,Ft＞F(0.05,3,3), 回歸方程顯著，剩余標準差s＝0.127，回歸方程有意義,由回歸方程因素的系數(shù)可見固液比、乙醇濃度和超聲波強度量的影響均為正效應，從標準回歸系數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，固液比＞超聲波強度＞乙醇濃度。再將方程在計算機上進行優(yōu)化處理，Y的期望值方向大者為佳。根據(jù)回歸方程得出最優(yōu)組合：A=15，B=50%，C=20，預測值Y=2.53%。從而得出總黃酮提取的最佳工藝為超聲波強度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%。

表1 U7(73)均勻試驗方案及試驗結(jié)果

2.2 驗證方案 按照最優(yōu)工藝參數(shù)(超聲波強度2000w,固液比1：15，乙醇濃度50%進行了3次平行試驗，顯示提取率可穩(wěn)定為(2.59±0.06)%，與預測值相符，而且重復性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 降糖作用的研究 模型組小鼠血糖值顯著高于正常組;糖尿病模型大鼠給予黃酮治療后小鼠的血糖與模型組相比,顯著降低。說明銀杏葉黃酮可降低糖尿病大鼠血糖。

3 討論

采用均勻設計方案進行試驗，得到最優(yōu)工藝方案，試驗次數(shù)大大減小。超聲輔助提取銀杏葉中總黃酮，需要超聲波強度2000w,固液比1:15，乙醇濃度50%，黃酮提取率為(2.59±0.06)%，時間短，收率高，操作簡單，能耗低，常溫提取使黃酮類化合物不會因熱效應損失和降低活性節(jié)約資源。

本實驗顯示,模型組血糖水平較正常組顯著升高, 糖尿病模型小鼠經(jīng)黃酮治療后, 其血糖水平顯著性降低。本實驗中模型組血糖水平較正常組顯著升高,說明糖尿病小鼠存在一定的腎功能損害。糖尿病模型小鼠經(jīng)黃酮治療后,其血糖水平顯著性降低,說明黃酮對腎臟具有一定的保護作用，具有很好的應用前景。

[1] 何曉靜,朱美玲,宋潔.銀杏葉總黃酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡相關基因表達的影響[J].安徽醫(yī)科大學學報,2006,41(3):283-285.

[2] 原愛紅,黃哲,馬駿.銀杏葉黃酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草藥,2004,35(11):1242-1243.

[3] 宋晚平,張鞍靈,高錦明.化感植物向日葵根提取液的抑菌活性研究[J].西北植物學報,2004,24(10):291-293.

[4] 陳濤,李進,褚治德.黃芪藥材的微波提取工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(2):349-350.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.33.031

462300 漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院 (胡旭濤)