阿柔比星建立腎病模型的評價

吳漢利 孫 偉

1 南京中醫藥大學（南京 210046）

2 江蘇省中醫院（南京 210029）

微小病變型腎病(MCN）是腎病綜合征(NS）中常見的病理類型之一,臨床表現為原發性NS。MCN約占兒童NS中的80% ～90%、成人NS中的20% ～30%[1]。因此,研究急性腎病模型在兒童腎病研究中顯得尤為重要。目前應用的ADR微小病變性腎病模型的制作由Tullio Bertani等[2]于1982年創立，魯斌等[3]將此法進行改進，造模后約1個月出現典型NS表現。但此法死亡率很高,動物常死于ADR毒副作用引起的嚴重腹瀉及心臟毒性，目前國外已很少應用此模型。為此，本試驗采用毒性低的阿柔比星分次尾靜脈注射的方法建立腎病模型并從血生化、病理變化方面對阿柔比星腎病模型進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級純系SD大鼠30只,雌性,體重(200±20）g,購自軍事醫學科學院實驗動物中心 (許可證編號：SCXK京2007－004），適應性喂養1周,測尿蛋白陰性后進入實驗。實驗期間,所有大鼠自由飲水,進食普通飼料。

1.2 實驗藥物 多柔比星,規格10mg/支(深圳萬樂藥業有限公司生產）；阿柔比星,規格20mg/支(深圳萬樂藥業有限公司生產）。

1.3 模型建立與分組 造模方法采用分次注射法。30只大鼠隨機分為正常組、阿柔比星組、多柔比星組。模型組每只鼠分2次經尾靜脈注射相應藥物；第1次注射4mg/kg，間隔1周，再注射3mg/kg。正常組以同樣方法注射相應量的生理鹽水。從第1次給藥起,于第1、2、3、4周末留取24h尿,其間給予高蛋白飲食。第4周末處死大鼠，取材。

1.4 實驗方法 尿蛋白定量測定采用免疫比濁法；血漿白蛋白測定采用溴甲酚綠法；總蛋白測定采用雙縮脲法；血清膽固醇測定采用膽固醇氧化酶法；血肌肝測定采用苦味酸速率法。腎病模型的病理變化在光鏡、電鏡下進行觀察。光鏡由山東省濰坊市益都中心醫院病理室完成，常規行HE、PAS染色觀察。組織切片的電鏡觀察由南京軍區總醫院電鏡室完成。腎皮質組織經3%戊二醛、1%鋨酸雙固定,磷酸緩沖液漂洗,丙酮系列脫水,E-pon812樹脂包埋,LKBV型切片機超薄切片,醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙染色,最后使用JEOL Jem－1011型電鏡進行觀察。

1.5 統計學處理 應用SPSS 11.5統計軟件。計量資料以(）表示,采用方差分析和!2檢驗。

2 結果

2.1 各組一般情況比較 見表1。實驗第1周,多柔比星組大鼠食量下降,部分大鼠出現不同程度的腹瀉。第3周出現輕度腹水。第4周水腫加重，體重逐漸下降；阿柔比星組出現類似情況，但癥狀輕，體重無明顯變化。實驗結束多柔比星組大鼠死亡4只，阿柔比星組無死亡。阿柔比星大鼠生存數與多柔比星組相比，組間差異具有統計學意義(P＜0.05）。

表1 各組死亡率比較（n）

2.2 各組24h尿蛋白定量分析結果比較 見表2。阿柔比星組與多柔比星組從第2周起尿蛋白逐漸升高,明顯高于正常組(P＜0.05或0.01）。阿柔比星組與多柔比星組同時間點比較，差異無統計學意義(P＞0.05）。

表2 各組24h尿蛋白尿定量分析結果比較（mg/24h,）

表2 各組24h尿蛋白尿定量分析結果比較（mg/24h,）

時間0d 7d 14d 21d 28d正常組4.11±0.70 4.51±1.57 4.29±1.87 4.51±1.52 4.47±0.89阿柔比星組3.90±0.85 5.81±1.08*17.53±5.97*43.88±9.44**80.15±6.87**多柔比星組3.15±0.89 3.69±0.76 24.23±10.67**43.11±16.74**108.88±35.54**

2.3 各組24h血清生化定量分析結果比較 見表3。與正常組相比,阿柔比星組與多柔比星組血清膽固醇顯著升高，而白蛋白顯著降低(P＜0.01）。阿柔比星組與多柔比星組血清膽固醇、白蛋白同時間點比較，差異無統計學意義(P＞0.05）；3組血肌酐、尿素氮指標差異均無統計學意義(P＞0.05）。

表3 各組24h血清生化定量分析結果比較（）

表3 各組24h血清生化定量分析結果比較（）

項 目白蛋白（mg/24h）膽固醇（mmol/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）正常組25.88±1.46 1.58±0.30 7.72±0.81 38.14±5.00阿柔比星組13.51±0.94**4.51±0.51**7.74±1.17 37.36±2.54多柔比星組14.00±2.50**4.46±1.18**7.55±0.36 35.73±2.50

2.4 光鏡變化 如圖1。第28日光鏡PAS染色情況，與正常組相比,阿柔比星組與多柔比星組腎臟病理檢查無明顯變化。

圖1 PAS染色情況

2.5 電鏡檢查 如圖2。與正常組相比，阿柔比星及多柔比星組腎小球上皮細胞足突廣泛融合，基底膜增厚。

3 討論

圖2 電鏡情況

ADR腎病模型是類似人類微小病變型腎病的動物模型。有關研究已證實,其造模機理是含醌的多柔比星在腎臟內被代謝還原為半醌型自由基,后者與氧反應產生活性氧,誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應,改變腎小球上皮細胞糖蛋白代謝,破壞腎小球濾過膜的結構和功能,最終導致膜濾過屏障的選擇性變化而引起蛋白尿[4]。但此法造模大鼠死亡率高,常死于ADR毒副作用引起的嚴重腹瀉及心臟毒性。此外造模的不均一性也嚴重影響了ADR腎病模型的應用。目前國外已很少應用此模型。

本實驗的目的在于建立穩定可靠的急性腎病模型。我們選用同樣具有腎臟毒性的阿柔比星造模，評價其腎病模型的特點。阿柔比星為新型蒽環類抗生素類抗腫瘤藥，能抑制生物大分子合成,特別對RNA合成的抑制作用很強。

我們采用模型組分兩次經尾靜脈注射藥物的方法進行造模。正常組則以同樣方法注射等量的生理鹽水。本研究制作的阿柔比星模型大鼠第1次給藥后尿蛋白于第7日開始上升，于實驗第28日達80mg/24h，與正常組相比有明顯差異，同時伴有明顯低蛋白血癥、高膽固醇血癥。與多柔比星組相比，差異無統計學意義。病理光鏡顯示各組均無明顯變化。多柔比星和阿柔比星組電鏡均出現足突廣泛融合，符合微小病變型腎小球腎病病理變化，正常組則無明顯改變。由此可以看出，阿柔比星模型血生化、尿蛋白變化及病理改變與多柔比星模型相似。由于阿柔比星模型組大鼠腹瀉情況輕，大鼠未出現死亡，造模成功率，與多柔比星組相比，差異有統計學意義，說明阿柔比星模型造模成功率高。此外，阿柔比星組大鼠尿蛋白均一性高，說明該模型建造成立后穩定可靠。

總之，血生化、尿蛋白、病理變化均證明阿柔比星模型符合微小病變型腎病模型，同時該模型大鼠死亡率低，尿蛋白均一，值得進一步推廣。但本模型尿蛋白量偏低，是否可以通過增加阿柔比星用量以提高尿蛋白量，值得進一步研究。

[1]楊霽云.微小病變型腎病[J].中華腎臟病雜志,1986，2（2）：150.

[2]Bertani T,Poggi A,Pozzoni R,et al.Adriamycin－induced nephrotic syndrome in rats[J].Laboratory Investigation,1982,46：16.

[3]魯斌，李新民，馬融.對改造的阿霉素腎病模型的評價[J].實驗動物科學與管理,1999，16（3）：5 ～9.

[4]姜新猷,胡明昌.柔紅霉素腎病：活性氧誘發脂質過氧化反應引起的腎組織損傷[J].中華腎臟病雜志,1991,7（7）：74.