鎘或鉻脅迫對擬穴青蟹血細胞總數和酚氧化酶活性的影響

蔣云霞，徐華，艾春香

（1. 南方醫科大學 公共衛生與熱帶醫學院，廣東 廣州 510515；2. 廈門大學 海洋與環境學院 福建 廈門 361005）

鎘或鉻脅迫對擬穴青蟹血細胞總數和酚氧化酶活性的影響

蔣云霞1，徐華2，艾春香2

（1. 南方醫科大學 公共衛生與熱帶醫學院，廣東 廣州 510515；2. 廈門大學 海洋與環境學院 福建 廈門 361005）

采用實驗生態學的方法研究了Cd2+或Cr6+脅迫1d，3d，5d，7d，9d后對擬穴青蟹血細胞總數 ( THC ) 和血清酚氧化酶 ( PO )活性的影響。結果表明，擬穴青蟹THC在Cd2+脅迫或Cr6+脅迫1d后即顯著下降 (P＜ 0.05 )，Cd2+脅迫對擬穴青蟹THC的影響較Cr6+脅迫大，持續時間長。隨著脅迫時間延長至9d后，Cr6+脅迫下的擬穴青蟹THC可逐漸恢復至與對照組差異不顯著狀態 (P＞ 0.05 )，然而0.075mg·L-1、0.1 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC仍顯著降低 (P＜ 0.05 )。擬穴青蟹血清PO活性在Cd2+脅迫或Cr6+脅迫均被顯著抑制 (P＜ 0.05 )，但劑量效應關系不明顯。 擬穴青蟹血清PO活性在Cr6+脅迫1d后即表現被抑制，但持續時間較短；在Cd2+脅迫組即在脅迫5d后才呈現出被抑制，但持續時間較長。由此可見， 鎘脅迫或鉻脅迫對擬穴青蟹THC和血清PO活性的影響顯著。

擬穴青蟹；鎘脅迫；鉻脅迫；血細胞總數；酚氧化酶活性

甲殼動物的免疫防御為非特異性免疫，其血細胞 ( hemocyte ) 和作為酚氧化酶原激活系統中主要成員的酚氧化酶 ( Phenoloxidase，PO，EC 1.10.3.1 ) 在抵御外來病原感染中起著關鍵性作用[1,2]。研究表明，重金屬顯著影響甲殼動物血細胞總數 ( total hemocyte counts，THC ) 和PO活性[3-5]。鎘 ( Cadmium，Cd ) 是環境中常見的高毒性污染物，其對水環境的污染已引起全球性的關注[6]，它能在甲殼動物中累積并引發一系列毒理效應[7,8]。鉻( chromium，Cr ) 作為與汞、鎘、鉛并列的四大污染重金屬之一，成為水體和底泥沉積物中常見的污染物[1-3]，它們在水生動物中累積并引發一系列毒理效應[6-8]。Cr價態多變，其中Cr6+和Cr3+是環境中鉻的主要存在形式， 且 Cr6+毒性較 Cr3+高 100 ～1000倍，因而受到許多研究者關注[9]。據我國海洋環境監測公報，我國海洋漁業水域沉積物中，鎘等重金屬污染嚴重。然而迄今，有關水體中的Cd2+或Cr6+脅迫對我國南方沿海重要養殖經濟蟹類——擬穴青蟹[Scylla paramamosain ( Estampador，1949 )] 生理生化影響尚未見報道。本試驗研究Cd2+或Cr6+脅迫對擬穴青蟹HTC和PO活性的影響，以期為蟹類環境免疫學研究積累資料，同時為擬穴青蟹健康養殖及環境重金屬污染的生態治理提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從廈門市第八菜市場采購附肢完整、體色鮮艷、活動力強、無病無傷，大小均勻，平均殼長為(5.72±0.61) cm，平均殼寬為 (7.05±0.73) cm，平均體重為 ( 112.9±19.4 ) g的擬穴青蟹為試驗對象。試驗用 Cd2+或 Cr6+離子源分別采用分析純的CdCl2·2. 5H2O，K2CrO4。

1.2 試驗方法

1.2.1 Cd2＋或 Cr6+濃度梯度的設定與分組Cd2＋或 Cr6+濃度按《中華人民共和國漁業水質標準》中 Cd2+≤0.005 mg·L-1的 5 倍、10 倍、15 倍、20 倍 ( 表 1 )，Cr6+≤0.1 mg·L-1的 5 倍、10 倍、20倍、40倍、80倍設置 ( 表2 )，未添加Cd2＋或Cr6+的自然海水為對照組，自然海水中 Cd2+濃度為0.350 μg·L-1，Cr6+濃度為 7.8 μg·L-1。試驗前將擬穴青蟹于自然海水中適應性馴養7d -10 d，然后隨機移入各Cd2＋或Cr6+濃度梯度組進行試驗。

按上述濃度設置，每組 18只蟹，分養于0.80 m × 0.58 m × 0.45 m的無毒塑料箱中，盛水體積50 L/箱，每處理組設3平行。

1.2.2 試驗條件 每個箱加蓋防逃網，箱中設置隱蔽物，試驗期間養殖水體溶解氧(DO)為 6.8 ±0.3 mg·L-1， pH 7.5 ± 0.3，溫度為 21 ± 1 ℃，鹽度為 29.5 ± 0.5。試驗采用半靜態法，每天更換 1/3 Cd2＋或Cr6+溶液，連續充氣。

表 1 鎘試驗處理組Tab. 1 Treatments of cadmium experiment

表 2 鉻試驗處理組Tab. 2 Treatments of chromium experiment

1.2.3 樣品制備 試驗開始后各處理組按第 1天、第3天、第5天、第7天、第9天隨機取樣，各濃度組隨機選取3只擬穴青蟹。先取血淋巴，隨后迅速取出其鰓、肝胰腺、肌肉，分別裝入1.5 mL的Eppendorf管，放入 -80℃ 冰箱中保存待測。

1.2.4 血淋巴中的 THC 按擬穴青蟹血淋巴∶抗凝劑為 1∶1的比例，將抗凝劑與血淋巴混合，制成一定稀釋倍數的細胞懸液，用普通血球計數板在光學顯微鏡下計數，每份樣品分別計數2～3 次，然后取其平均值?？鼓齽┎捎?0 mmol·L-1檸檬酸三鈉鹽、0.45 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1EDTA 配制而成。

1.2.5 酚氧化酶 PO活性測定： 以L-dopa為底物，參照 Ashida的方法[10]進行。將 3 mL的0.l mol·L-1，pH=6.0 的磷酸鉀鹽緩沖液與 100 μL 的0.0l mol·L-1的 L-dopa及 100 μL 血清于室溫下混勻，每間隔2min讀取在490 nm波長下的光密度值。以O.D.490對反應時間 ( min ) 作圖，以試驗條件下每分鐘O.D.490增加0.001定義為一個酶活性單位。

1.3 數據的處理與分析

所有數據以 3個重復組數據的平均值±標準差( Means±SD ) 表示，并采用單因素方差分析( ANOVA ) 和 Duncan 檢驗法統計分析。

2 結 果

2.1 鎘脅迫對擬穴青蟹THC的影響

Cd2+脅迫對擬穴青蟹THC的影響見表3。從表3中可以看出，擬穴青蟹THC在各濃度Cd2+脅迫1 d后即變化顯著。除0.025 mg·L-1Cd2+脅迫組外，其余濃度Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC均顯著低于對照組 ( P ＜ 0.05 )，且隨著Cd2+脅迫濃度的升高，THC降幅增大。脅迫3d后0.025 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC也顯著低于對照組 ( P ＜ 0.05 )，隨著脅迫時間延長，各濃度 Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC較對照組的顯著降低 (P＜ 0.05 )，9 d后0.025 mg·L-1、0.05 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC雖然仍低于對照組，與對照組相比差異不顯著(P＞ 0.05 )。

表 3 鎘脅迫對擬穴青蟹血細胞總數的影響*Tab. 3 Effect of Cd2+ stress on total haemocyte count of mud crab S.paramamosain*

2.2 鉻脅迫對擬穴青蟹THC的影響

Cr6+脅迫對擬穴青蟹THC的影響見表4。從表4中得知，8.0 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC在脅迫1 d后即顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )，其余濃度Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC與對照組差異不顯著 (P＞ 0.05 )。脅迫 3 d 后，0.5 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹 THC顯著升高(P＜0.05)，而 1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC則均顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )。隨著脅迫時間延長，各濃度 Cr6+脅迫組的擬穴青蟹 THC逐漸恢復正常，且與對照組差異不顯著 (P＞0.05 )。

表 4 鉻脅迫對擬穴青蟹血細胞總數的影響*Tab. 4 Effect of Cr6+ stress on total haemocyte count of mud crab S.paramamosain*

2.3 鎘脅迫對擬穴青蟹血清酚氧化酶活性的影響

Cd2+脅迫對擬穴青蟹血清中 PO活性變化見圖1。從圖1中可以看出，擬穴青蟹血清中PO活性在各濃度Cd2+脅迫1 d后，各Cd2+脅迫組間差異不顯著 (P＞ 0.05 )，脅迫 3 d 后，0.075 mg·L-1、0.1mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹血清中PO活性下降，但與對照組差異不顯著 (P＞ 0.05 )。脅迫5 d、7 d 后，0.1 mg·L-1、0.075 mg·L-1bCd2+脅迫組的擬穴青蟹血清中PO活性顯著下降 (P＜ 0.05 )，且這種顯著抑制效應一直持續至第 9天，且此時0.025 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹血清中PO活性也顯著降低 (P＜ 0.05 )。

2.4 鉻脅迫對擬穴青蟹血清酚氧化酶活性的影響

Cr6+脅迫對擬穴青蟹血清中PO活性的影響見圖2。從圖2中可以看出，擬穴青蟹血清中PO活性在各濃度 Cr6+脅迫 1d 后，0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1、8.0 mg·L-1Cr6+脅迫組均顯著低于對照組(P＜ 0.05 )，而 2.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1Cr6+脅迫組則較對照組有所下降，但差異不顯著 (P＞ 0.05 )。脅迫 3 d 后，除 1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹血清中 PO活性顯著低于對照組外(P＜ 0.05 )，其余濃度Cr6+脅迫組均與對照組差異不顯著 (P＞ 0.05 )。隨著Cr6+脅迫時間延長，各濃度Cr6+脅迫組的擬穴青蟹血清中PO活性均與對照組差異不顯著 (P＞ 0.05 )。

3 討 論

甲殼動物血細胞的吞噬、包囊、形成細胞結以及分泌體液因子等在機體抵抗外界病原體的侵入發揮著首要作用[11,12]，THC可作為衡量甲殼動物機體受脅迫或免疫狀態變化的一項敏感指標[12,13]。研究表明，環境因素變化均會對甲殼動物 THC產生影響[4,15-18]。

圖 1 鎘脅迫對擬穴青蟹血清酚氧化酶活性的影響*Fig. 1 Effect of Cd2+ stress on PO activity in the haemolymph of mud crab S.paramamosain

圖 2 鉻脅迫對擬穴青蟹血清酚氧化酶活性的影響Fig. 2 Effect of Cr6+ stress on PO activity in the haemolymph of mud crab S.paramamosain

本研究表明，Cd2+脅迫顯著降低擬穴青蟹THC(P＜ 0.05 )，且表現出劑量效應關系；隨著脅迫時間延長，各濃度Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC一直顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )，直至脅迫9 d后，0.025 mg·L-1、0.05 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹THC才恢復至與對照組差異不顯著的狀態(P＞ 0.05 )。長臂蝦 (Palaemon elegans) 暴露于濃度為 0.1 mg·L-1-10mg·L-1Cd2+溶液 5 h 后，其 THC顯著下降，隨后逐漸上升，96 h后除0.1 mg·L-1Cd2+濃度組外，其余Cd2+濃度組仍顯著低于對照組[19]，這與本研究結果相似。也有研究表明，重金屬脅迫可導致某些水生動物的血細胞總數增加，推測重金屬脅迫在一定程度上降低生物機體的免疫功能，機體采取增加 HTC以增強機體的抵抗力。太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)暴露于0.3 ppm和0.5 ppm的Cd2+3 ～ 7 d，其THC增加顯著，但不同類型細胞的比例變化卻不顯著[20]。擬穴青蟹暴露于不同Cr6+濃度1 d后，只有8.0 mg/L Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )，與Cd2+脅迫相比，擬穴青蟹對 Cr6+脅迫的敏感度低，觀測到0.5 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC在第3天后出現顯著升高的狀態 (P＜ 0.05 )，隨后又逐漸恢復至與對照組差異不顯著的狀態 (P＞ 0.05 )，而1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC則顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )，但第9天所有濃度Cr6+脅迫組的擬穴青蟹THC均與對照組差異不顯著 (P＞ 0.05 )，這說明擬穴青蟹對Cr6+的耐受能力較強。長臂蝦暴露于濃度為0.5 ～ 50 mg·L-1Cr6+溶液中 3 ～ 5 h 后發現其 THC 顯著下降 (P＜ 0.05 )[19]。暴露于濃度為 0.1 ～ 3.2 mg·L-1Cr6+溶液28 d后的鯰魚 (Saccobranchus fossilis)血液中紅細胞和白細胞的數量顯著降低，白細胞中的大、小淋巴細胞數量顯著降低，而中性細胞數量有所上升[21]，可見，不同水產動物對重金屬脅迫的響應存在差異。

本試驗發現，Cd2+或 Cr6+脅迫均對擬穴青蟹血清PO活性產生抑制效應，Cr6+脅迫1 d后即呈現明顯抑制效應，而Cd2+脅迫則在5 d后的最高濃度脅迫組才觀測到抑制效應。Cr6+脅迫對擬穴青蟹血清PO的抑制效應很快就減弱，Cd2+脅迫對擬穴青蟹血清PO的抑制效應卻持續至第9天仍能觀測到。與甲殼動物應激狀態下PO活性變化與血細胞數量相關，血細胞數量的升高會導致 PO活性上升[22]的研究結果不同，本研究卻未發現Cd2+或Cr6+脅迫下擬穴青蟹血清中的PO活性與血細胞數量存在相關性。Cd2+脅迫 1 d后，0.05 mg·L-1、0.075 mg·L-1、0.1 mg·L-1Cd2+脅迫組的擬穴青蟹血淋巴中THC顯著低于對照組，而相應組擬穴青蟹血清中PO活性與對照組差異卻不顯著 (P＞ 0.05 )；Cr6+脅迫 1 d 后，0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，8.0 mg·L-1Cr6+脅迫組的擬穴青蟹血清中PO活性均顯著低于對照組(P＜ 0.05 )，但擬穴青蟹血淋巴中 THC 僅在8.0 mg·L-1Cr6+脅迫組顯著低于對照組 (P＜ 0.05 )。本試驗結果與 Hauton等的研究發現較為一致，他們提出PO活性的變化與血細胞數量的改變不能構成因果關系，而細菌等外源物質的刺激會影響 PO活性[23]。有關重金屬對PO活性抑制作用機理尚不十分清楚。推測 Cd2＋或 Cr6+脅迫對擬穴青蟹 PO活性影響的可能機理是：Cd2+進入擬穴青蟹機體后干擾銅、鈷、鋅等機體必需微量元素的代謝，從而影響擬穴青蟹體內酚氧化酶、血藍蛋白的正常生物合成，導致PO活性下降，血藍蛋白攜氧能力降低，已證實缺氧可導致藍蟹 (Callinectes sapidus) 血淋巴中PO活性受到抑制[24]。Cr6+以陰離子的形式進入生物機體，并能在機體內進行氧化還原反應，在 Cr6+還原為 Cr3+的過程中，可使谷胱甘肽還原酶活性受到抑制，從而使血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，導致紅細胞攜帶氧的功能發生障礙[25]，引起生理性缺氧現象的發生，甲殼動物是否有同樣的反應有待于進一步研究。

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Effects of Cd2+or Cr6+stress on the THC and PO activity of mud crabScylla paramamosain

JIANG Yun-xia1, XU Hua2, AI Chun-xiang2

(1. School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
2. College of Oceanography and Environmental Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

An experimental ecology method was conducted to investigate the total haemocyte count (THC) and PO activity in serum ofScylla paramamosainexposed to different concentrations of water-borne Cd2+( 0.000 mg·L-1,0.025 mg·L-1,0.05 mg·L-1, 0.075 mg·L-1,0.1 mg·L-1) or Cr6+( 0.0 mg·L-1, 0.5mg·L-1, 1.0mg·L-1, 2.0mg·L-1, 4.0mg·L-1,8.0mg·L-1) from 1d to 9d. Each treatment was conducted in triplicate. The results showed that THC ofScylla paramamosaindecreased significantly when exposed to different concentrations of Cd2+or Cr6+after 1d (P＜ 0.05).The crab had more sensitive to Cd2+exposure. The decreasing of THC induced by Cd2+( 0.075mg·L-1, 0.1mg·L-1)stress groups had significant difference from the control group after 9d exposure (P＜ 0.05), but Cr6+didn’t. THC ofScylla paramamosainapproximated to control group after 9d exposed to Cr6+, however, THC still decreased after 9d exposed to Cd2+exposure. Phenoloxidase activity was significantly suppressed in serum when exposed to different concentrations of Cr6+after 1d (P＜ 0.05), and inhibitory effect was shorter duration, while exposed to different concentrations of Cd2+after 5d, and inhibitory effect was longer duration. In conclusion, the effects of Cd2+or Cr6+stress on the THC and PO activity ofScylla paramamosainwere significant.

Scylla paramamosain; cadmium(Cd2+); chromium ( Cr6+) stress; THC; PO activity

Q256;Q959.233

A

1001-6932(2010)06-0649-05

2009-10-16；收修改稿日期：2010-02-10

國家863計劃項目 ( 2007AA091406 )；公益性行業 ( 農業 ) 科研專項 ( nyhyzx07-043 )

蔣云霞（1973—），女，博士，講師，主要從事環境衛生學的教學與科研工作，電子郵箱：jiangyxia@yahoo.com.cn。

艾春香（1967—），電子郵箱：chunxai@xmu.edu.cn。