高羊茅EST-SSR標記的開發(fā)及品種鑒定

摘要：利用EST-SSR分子標記對11份高羊茅(Festuca arundinacea)材料進行了品種鑒定研究。在優(yōu)化DNA提取方法、擴增體系的基礎上對50對EST-SSR引物進行篩選，結果表明：有42對引物可以在高羊茅上得到有效擴增，對11份高羊茅品種的鑒定結果表明，其中12對引物具有良好的多態(tài)性，占28.6％；共檢測到86個等位基因，平均每個位點的等位基因數(shù)為4.5個，變幅為3-12。從譜帶類型上看：S3和S44引物擴增的譜帶類型最少(2種)，多態(tài)性百分率最低，為18.2％；S11引物擴增的譜帶類型最多(9種)，多態(tài)性百分率最高，為81.8％；共擴增到多態(tài)性譜帶65種，平均多態(tài)百分率為59.1％。

關鍵詞：高羊茅；品種鑒定；EST-SSR

中圖分類號：Q789；S688.403.7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)10-O007-04

高羊茅(Festuca arundinacea)別名葦狀羊茅，屬禾本科(P0aceao)早熟禾亞科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)羊茅屬內(nèi)的Boyinae亞屬，是溫帶地區(qū)廣泛種植的六倍體多年生草坪草。作為耐熱的冷季型草坪草，不但能忍受冬季低溫，而且也能在一定程度上忍受夏季的高溫而不至于枯黃，因此適合在我國大部分地區(qū)生長，近年來已成為我國主要的草坪草之一。

我國高羊茅種子主要依靠進口。一些不法種子經(jīng)營者唯利是圖，以劣質(zhì)高羊茅種子充斥市場，給生產(chǎn)造成極大的損失，生產(chǎn)者、經(jīng)營者對高羊茅純度檢驗的要求日益迫切。由于高羊茅是多倍體作物，其異花授粉和自交不親和性限制了經(jīng)典遺傳學研究的深入開展，分子標記是解開這道難題的便利途徑。

目前已經(jīng)開展的高羊茅分子標記研究包括：由Southern雜交衍生的RFLPs標記(Re-striction Fragment Length Polymorphisms，限制性片段長度多態(tài)性)和基于PCR擴增的標記，包括RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)、AFLP(Amplified FragmentsLength Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)、SSR(Simple Sequence Repeats，簡單重復序列，又稱微衛(wèi)星DNA)及ISSR(Inter-simple Sequence Re-peats，即簡單重復序列間擴增，或錨定SSR)等，另外PCR和RFLP結合的PCR-RFLP也已經(jīng)得到應用。這些研究主要應用在遺傳圖譜構建、比較基因組作圖、系統(tǒng)分類親緣關系的研究、遺傳多樣性的分析和利用品種指紋圖譜進行雜種鑒定。而利用EST-SSR進行高羊茅品種鑒定尚未見報道。本研究擬對11個優(yōu)良高羊茅品種的遺傳多樣性進行SSR分析，以期為高羊茅快速品種鑒定技術提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

試驗材料：從山東各地市場搜集的主栽高羊茅品種11份，分別是：Amigo、Alamo、Quest、Re-ward、王朝、凌志、維加斯、金王月、翠碧、南方選擇、爆炸組合。

引物序列：來自文獻中EST-SSR，利用DNAman軟件進行重新設計，設計原則如下：SSR序列的開始和結束位置分別距5ˊ和3ˊ端不少于20bp；引物長度19-24bp；退火溫度Tm值50-67℃。且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；(G+C)含量30％-70％；PCR擴增產(chǎn)物長度100-600bp；盡量避免引物二級結構和寡二聚體的出現(xiàn)。最后篩選到50對引物交付上海生工生物技術服務有限公司合成。PCR所用的Mg²⁺、Taq酶、dNTP、Buffer均購自上海生工生物技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取高羊茅是一種常異花授粉植物。根據(jù)預備試驗單株幼苗的提取效果和文獻報道得出的有代表性的取樣量，每品種隨機選取30個生長良好的發(fā)芽7天后的單株幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法和Tiangen試劑盒法提取DNA并進行比較試驗。

利用1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，樣品于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應體系的建立及優(yōu)化

對Mg²⁺濃度、dNTP、引物濃度、Taq酶濃度進行4因素3水平的正交試驗，并在BIOMETRA TGRADIENT梯度PCR儀上進行引物最佳復性溫度的篩選。最適合于高羊茅SSR分析的20μl優(yōu)化反應體系為：模板10ng/μl，dNTP 240μmol/L，引物濃度0.4μmol/L，Taq酶1.0 U，Mg²⁺2.5mmol/L。PCR反應程序為：94℃預變性4min；94℃變性30s，50-57℃變性30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

1.3 電泳檢測

PCR產(chǎn)物先經(jīng)3％瓊脂糖凝膠(含1％Gold-viewII)電泳檢測擴增效果后，再經(jīng)6％脲變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染方法參照文獻的改進方法，最后進行照相。

2、結果與分析

2.1 基因組DNA提取及檢測

以Alamo幼苗進行的DNA提取方法的比較試驗結果(見圖1)表明：CTAB法提取的DNA量大，但存在嚴重的拖尾，可能是因為所提取的DNA分子量范圍比較大或者存在殘余的RNA。而Tiangen試劑盒法提取的DNA亮度較小，但電泳條帶很狹窄，說明所提取的DNA分子量范圍均一，試劑盒中存在RNase，可以將殘余的RNA降解掉。同時CTAB法需要1.5個工作日而Tian-gen法僅需要0.5個工作日，提高了工作效率。

2.2 EST-SSR標記在高羊茅上的通用性

通過對50對EST-SSR引物的篩選，發(fā)現(xiàn)有42對可以從11種高羊茅上得到有效擴增產(chǎn)物，占引物總數(shù)的84％。但不同引物擴增情況不同。從擴增片段大小上看，大部分在預期片段范圍內(nèi)(表1)，個別位點上出現(xiàn)了比預期產(chǎn)物大的片段。同時擴增到的片段數(shù)目也不盡相同。擴增片段大小的不同則反映出內(nèi)含子的插入與否或等位基因間SSR重復模體單元的差異。擴增片段數(shù)目的差異說明相應位點上的等位基因數(shù)目不同。

2.3 供試材料SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

有效擴增的42對EST-SSR引物的電泳譜帶多態(tài)性分析表明，42對引物中有12對(表1)在不同樣品間產(chǎn)生多態(tài)性分離，引物的多態(tài)性比率為28.6％。其它引物在不同樣品間獲得的譜帶類型一致，沒有分離。因此主要利用這12對核心引物進行品種鑒定。

供試的11份高羊茅材料的擴增結果見表2。可以看出：共檢測到86個等位基因，平均每個位點的等位基因數(shù)目是4.5個，變幅為3-12；從譜帶類型上看：S3和S44引物擴增的譜帶類型最少(2類)，多態(tài)性百分率最低，為18.2％，而S11引物擴增的譜帶類型最多(9種)，多態(tài)性百分率最高，為81.8％；共擴增到多態(tài)性譜帶65種，平均多態(tài)百分率為59.1％。

從品種鑒定的角度看，以引物S11為例，擴增到了9種多態(tài)性譜帶(圖2)，其中Amigo和Quest具有相同的譜帶，金王月和爆炸組合具有相同的譜帶，而其他品種在這個位點上譜帶不同。試驗中發(fā)現(xiàn)不同引物不同品種擴增的產(chǎn)物存在譜帶重合的情況，因此只用1個引物進行品種鑒定區(qū)分是很不合理的，必須結合其他引物進行綜合的判斷。品種間存在兩個以上的位點有區(qū)別才算作兩個不同的品種。試驗表明，利用SSR技術進行高羊茅品種鑒定是可行、有效的。

3、討論與結論

3.1 高羊茅種子昂貴，且國內(nèi)高羊茅草坪生產(chǎn)用種主要靠從國外引進，隨著貿(mào)易量的逐年增多，加快檢疫速度迫在眉睫。Tiangen試劑盒法對比傳統(tǒng)的CTAB法提取的總DNA數(shù)量可能較少，但質(zhì)量高，試劑盒中的RNase可以有效去除RNA，同時提取時間較短，可以降低降解的概率同時又大幅度提高工作效率(從18h減到6h)。有效縮短檢測周期才能滿足貿(mào)易性進口種子快速檢疫通關的需求，這對于建立快速室內(nèi)品種鑒定技術是很有意義的。

3.2 與來源于基因組的SSR標記相比，EST－SSR標記來源于相對保守的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，所以比基因組SSR標記具有更高的通用性。這與本試驗的結果是一致的。因此，雖然EST-SSR標記的開發(fā)僅限于EST序列數(shù)據(jù)庫早已存在的物種，但對于一個特定物種，若缺乏相關的序列資料，源于其他近緣種的EST-SSR標記將是有效和可用的標記資源，這將節(jié)約引物的開發(fā)成本，也為比較基因組學研究提供了一個新途徑。

3.3 本研究從篩選出的42對SSR引物中，選取擴增譜帶穩(wěn)定性較好、多態(tài)性和分辨率較高的12對，利用它們的電泳圖譜組合構成了供試高羊茅材料特有的DNA指紋，將這些材料逐一區(qū)分開。試驗表明，SSR標記具有高分辨力特性及共顯性的遺傳方式，用于高羊茅鑒定是可行的。從構建高羊茅品種鑒定規(guī)程的角度看，本試驗所選取的位點數(shù)目以及涉及的品種還很有限，是否可以有效鑒別其他高羊茅品種還需進行深入研究。

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